Bakterielle Amylasen ermöglichen den Glykogenabbau durch das vaginale Mikrobiom

Apr 15, 2024

Nature Microbiology Band 8, Seiten 1641–1652 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die vaginale Mikrobiota des Menschen wird häufig von Laktobazillen dominiert und der Übergang zu einer vielfältigeren Gemeinschaft anaerober Mikroben ist mit Gesundheitsrisiken verbunden. Es wird angenommen, dass das von lysierten Epithelzellen freigesetzte Glykogen eine wichtige Nährstoffquelle in der Vagina ist. Allerdings ist der Mechanismus, durch den Vaginalbakterien Glykogen verstoffwechseln, unklar, und es gibt Hinweise darauf, dass sowohl bakterielle als auch menschliche Enzyme beteiligt sind. Hier charakterisieren wir biochemisch sechs Glykogen abbauende Enzyme (GDEs), die allesamt Pullanasen (PulA-Homologe) aus Vaginalbakterien sind, die das Wachstum von Amylase-defizientem Lactobacillus Crispatus auf Glykogen unterstützen. Wir zeigen Unterschiede in ihrer pH-Toleranz, Substratpräferenzen, Abbauprodukten und Hemmungsanfälligkeit auf. Die Analyse vaginaler Mikrobiomdatensätze zeigt, dass diese Enzyme in allen Gemeinschaftszustandstypen exprimiert werden. Schließlich bestätigen wir das Vorhandensein und die Aktivität von bakteriellen und menschlichen GDEs in der Zervikovaginalflüssigkeit. Diese Arbeit belegt, dass bakterielle GDEs am Abbau von Glykogen beteiligt sein können, und liefert Einblicke in den Stoffwechsel, der die vaginale Mikrobiota prägen kann.

Dysbiose innerhalb der vaginalen Mikrobiota des Menschen ist mit gesundheitsschädlichen Folgen verbunden1. Die Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft kann taxonomisch in einen von fünf Community State Types (CSTs)2 eingeteilt werden. CST I–III und V werden von einer einzigen Lactobacillus-Art dominiert: L. crushatus, L. gasseri, L. iners bzw. L. jensenii. Im Gegensatz dazu besteht CST IV aus einer vielfältigen Gruppe anaerober und fakultativ anaerober Mikroben, darunter Arten von Gardnerella, Prevotella, Mobiluncus und geringe Mengen Lactobacillus. Die von Lactobacillus dominierten CSTs sind mit einem vaginalen pH-Wert unter 4,5, niedrigen Nugent-Werten und einer geringeren Entzündung verbunden3, wohingegen CST IV mit einem höheren pH-Wert und mehreren gesundheitlichen Folgen verbunden ist, darunter HIV-Infektion4, bakterielle Vaginose5 und Frühgeburt6. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass CST IV bei gesunden hispanischen und schwarzen Frauen überrepräsentiert ist und nicht unbedingt auf eine Dysbiose hinweist7. Insgesamt ist klar geworden, dass die Zusammensetzung der vaginalen Mikrobiota allein nicht ausreicht, um Gesundheitsergebnisse vorherzusagen, und dass für die Erlangung eines mechanistischen Verständnisses dieser Gemeinschaft die Entschlüsselung vaginaler Bakterienfunktionen erforderlich ist1.

Eine Funktion, die bekanntermaßen die Zusammensetzung und Stabilität wirtsassoziierter Bakteriengemeinschaften beeinflusst, ist die Freisetzung von Kohlenhydraten aus Nahrungs- oder Wirtsquellen durch Glykosidhydrolasen. Während dies in der menschlichen Darmmikrobiota gut bekannt ist8,9,10,11, ist der Kohlenhydratstoffwechsel in der vaginalen Umgebung nur unzureichend verstanden. Es wird allgemein angenommen, dass das von abgeblätterten und lysierten Epithelzellen freigesetzte Glykogen die Kolonisierung vaginaler Laktobazillen unterstützt12,13, da die Glykogenspiegel in Vaginalproben mit der Dominanz von Lactobacillus und einem niedrigen vaginalen pH-Wert in Zusammenhang stehen14. Allerdings waren bis vor Kurzem Versuche, vaginale Lactobacillus-Isolate zu gewinnen, die auf Glykogen wachsen können, weitgehend erfolglos15,16, was die Frage aufwirft, ob und wie Vaginalbakterien auf diese Kohlenstoffquelle zugreifen.

Glykogen besteht aus linearen Ketten von α-1,4-glykosidisch verknüpften Glucoseeinheiten mit periodischen α-1,6-glykosidischen Verzweigungen. Der Glykogenstoffwechsel erfordert extrazelluläre Glykosidhydrolasen, um kürzere Glucosepolymere (Maltodextrine) freizusetzen. Mehrere vaginale Laktobazillen nutzen Maltodextrine für das Wachstum, was zu einer ersten Hypothese führt, dass eine Nicht-Lactobacillus-Glycosidhydrolase in der Vaginalumgebung diese Oligosaccharide freisetzt17. Der Nachweis von menschlicher α-Amylase in zervikovaginalen Lavageproben (CVLs) könnte diesen Vorschlag unterstützen17,18. Wie menschliche Amylase, die vorwiegend in der Bauchspeicheldrüse und den Speicheldrüsen17 produziert wird, in der Genitalflüssigkeit vorkommt, ist jedoch noch nicht geklärt.

Zusätzlich zur menschlichen Amylase identifizierten neuere Arbeiten andere Glykogen abbauende Enzyme in der Vaginalflüssigkeit, darunter Glucosidasen des Parasiten Trichomonas vaginalis und mehrere nicht charakterisierte bakterielle Enzyme, die mittels Proteomik nachgewiesen wurden19,20,21. Insbesondere wurde eine mutmaßlich sekretierte Typ-1-Pullulanase (PulA, EEU28204.2) aus L. Crispatus als Kandidat für das Glykogen abbauende Enzym (GDE) vorgeschlagen, und zwar auf der Grundlage der Variation von Stamm zu Stamm in seinem vorhergesagten Signalpeptid (SP). ), was mit dem Wachstum auf Glykogen korreliert22,23.

Pullulanasen hydrolysieren die α-1,6-glykosidischen Bindungen in Pullulan und anderen verzweigten Oligosacchariden und setzen Maltodextrine frei24. Homologe von PulA sind in verschiedenen vaginalen Bakteriengenomen kodiert25, was darauf hindeutet, dass dieses Enzym nicht auf L. Crispatus beschränkt ist und die Möglichkeit einer bakteriellen Konkurrenz um Glykogen hervorhebt. Insbesondere wurden in Proteomikstudien mutmaßliche Pullulanasen aus L. iners und Gardnerella vaginalis in CVLs identifiziert, ihre Aktivität wurde jedoch nicht biochemisch validiert21. Die vorhergesagte α-1,6-glykosidische Bindungsspezifität von Pullulanasen wirft Fragen hinsichtlich des Schicksals des verbleibenden Glykogenrückgrats und der Frage auf, wie längere Zweige hydrolysiert werden. Die Identifizierung dieser bakteriellen Enzyme wirft auch Fragen zur relativen Rolle der menschlichen Amylase im vaginalen Ökosystem auf. Offensichtlich ist eine biochemische Charakterisierung vaginaler bakterieller Enzyme erforderlich, um unser Verständnis des Glykogenstoffwechsels in dieser Umgebung zu verbessern.

Hier berichten wir über die biochemische Charakterisierung von sechs PulA-Homologen aus Vaginalbakterien, die Lactobacillus-dominierte CSTs (I und III) und die diversen CST IV repräsentieren. Unsere Studie zeigt, dass diese Enzyme trotz einer gemeinsamen Anmerkung Variabilität in ihren pH-Profilen, Profilen der Glykogenabbauprodukte, Substratpräferenzen und Anfälligkeit gegenüber Inhibitoren aufweisen. Durch die Analyse von Multi-Omics-Datensätzen zeigen wir, dass die für diese GDEs kodierenden Gene in allen CSTs vorhanden sind und transkribiert werden. Mithilfe eines aktivitätsbasierten Proteinprofils (ABPP)26 und eines selektiven enzymatischen Tests zeigen wir, dass sowohl menschliche als auch bakterielle GDEs in der zervikalen Vaginalflüssigkeit (CVF) vorhanden und aktiv sind. Insgesamt liefert diese Arbeit molekulare Einblicke in den bakteriellen Stoffwechsel einer reichlich vorhandenen Kohlenstoffquelle in der vaginalen Mikrobiota.

Um Kandidaten für vaginale bakterielle GDEs zu identifizieren, führten wir eine BLASTp-Suche von 151 vaginalen Isolatgenomen in der IMG-Datenbank durch, wobei wir L. Crispatus PulA (EEU28204.2) als Abfragesequenz22 verwendeten, mit einem Grenzwert von 35 % Aminosäureidentität. Die Treffer wurden weiter auf solche eingegrenzt, die sowohl eine Glykosid-Hydrolase-Domäne als auch ein Signalpeptid enthalten, da der Glykogenabbau extrazellulär erfolgt27. Insgesamt wurden 62 Homologe in Stämmen von 11 Bakterienarten identifiziert (Ergänzungsdatei 1), darunter L. Crispatus (7/9 Stämme in der Datenbank, durchschnittlich 99 % Aminosäureidentität für unsere Abfrage), L. iners (12/13). , 45 %), Mobiluncus mulieris (2/4, 43 %), Prevotella bivia (2/2, 40 %) und G. vaginalis (15/18, 37 %). Die Gennachbarschaftsanalyse ergab eine weitere Signalpeptid-haltige Glycosidhydrolase (GH13), die neben dem P. bivia-PulA kodiert (25 % Identität mit PulA), sodass diese Sequenz ebenfalls einbezogen wurde. Nachfolgende Charakterisierungsbemühungen konzentrierten sich auf diesen Proteinsatz. Wir haben auch potenzielle Homologe mit geringerer Identität entdeckt (Ergänzungsdatei 1), darunter eines aus Streptococcus agalacticae und ein deutlich kleineres Protein in G. vaginalis, das homolog zu einem kürzlich beschriebenen α-Glucosidase-Enzym ist, das auf Maltose und andere Oligosaccharide aktiv ist, aber kein Glykogen abbaut28 .

Die PFAM-Domänenanalyse ergab, dass alle sechs Kandidaten-GDEs eine S-Layer-Protein-A-Domäne (SlpA), eine Zellwandbindungsdomäne (CWB) oder Transmembranhelices (TM) enthalten, was auf eine Lokalisierung auf der Zelloberfläche schließen lässt29,30,31. Darüber hinaus enthält jedes Protein mindestens eine katalytische α-Amylase-Domäne (PF00128), ein Mitglied der Glycosid-Hydrolase-13-Enzymfamilie, von der bekannt ist, dass sie verschiedene glycosidische Bindungen spaltet32. Interessanterweise verfügt das G. vaginalis-Enzym über zwei Amylasedomänen. Mehrere Enzyme besitzen mutmaßliche Kohlenhydrat-bindende Domänen, die bakteriellen Enzymen dieser Klasse gemeinsam sind, einschließlich der Pullulanase-Domäne (PUD; PF03714)33. Weitere kohlenhydratbindende Module (CBMs) aus der CAZy-Datenbank, die in diesen Enzymen gefunden werden, umfassen CBM25 und CBM48, die an der Bindung verschiedener linearer und zyklischer α-Glucane im Zusammenhang mit Stärke und Glykogen beteiligt sind32,34 und an der multivalenten Bindung an lösliches Amylopektin und Pullulan35 ( Abb. 1a).

a, Vorhergesagte Domänen in mutmaßlichen vaginalen bakteriellen extrazellulären GDEs. α-Amylase, katalytische α-Amylase-Domäne (GH13); C-Malz, Cyclomaltodextrinase-Domäne. b: Wachstum von L. Crispatus C0176A1 (pulA−, JAEDCG000000000) und MV-1A-US (pulA+) auf verschiedenen Kohlenstoffquellen. c, L. Crispatus C0176A1 (pulA−), gezüchtet auf Austernglykogen, ergänzt mit 200 nM gereinigtem L. Crispatus PulA. d, 24 h OD600-Werte von L. Crispatus C0176A1 (pulA−), gewachsen auf Glucose, Maltose oder Glykogen, ergänzt mit 200 bis 400 nM gereinigtem Protein (L. Crispatus PulA vs. M. mulieris PulA, P = 0,0084; L. Crispatus PulA vs P. bivia PulA, P < 0,0001; L. Crispatus PulA vs. P. bivia GH13, P < 0,0001). Alle Wachstumskurven sind repräsentativ für drei experimentelle Replikate (n = 3). Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert aller erfassten Daten dar. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde eine einfache Varianzanalyse (ANOVA) mit mehreren Vergleichen (Tukey) durchgeführt. **P ≤ 0,01, ****P ≤ 0,0001.

Quelldaten

Um ihre Fähigkeit zum Abbau von Glykogen zu untersuchen, exprimierten und reinigten wir jedes Enzym heterolog (Extended Data Abb. 1 und Supplementary Abb. 1) und testeten dann, ob es das Wachstum eines pulA-defizienten L. Crispatus-Stammes auf Glykogen rettete (Abb. 1b, c und erweiterte Daten Abb. 2). Die Zugabe von gereinigtem L. Crispatus-PulA zum Medium stellte das Wachstum wieder her und lieferte den direkten Beweis dafür, dass PulA für den Glykogenstoffwechsel von L. Crispatus ausreicht22 (Abb. 1c und erweiterte Daten Abb. 2). Die anderen Enzyme unterstützten ebenfalls das Wachstum (Abb. 1d und erweiterte Daten, Abb. 2), obwohl die geringeren Dichten von Kulturen, die mit den Enzymen M. mulieris PulA und P. bivia gezüchtet wurden, darauf hindeuten, dass sie beim Glykogenabbau nicht so effizient sind oder dass dies der Fall ist Bestimmte Oligosaccharidprodukte sind für L. Crispatus nicht so zugänglich.

Als nächstes haben wir die Abbaukinetik verschiedener Glucosepolymere gemessen, um die Substratpräferenz und Spezifität jedes Enzyms für verschiedene glykosidische Bindungen zu bestimmen (Tabelle 1 und erweiterte Daten, Abb. 3). Zusätzlich zu Glykogen testeten wir Amylose, die ausschließlich aus α-1,4-glykosidischen Bindungen besteht, und Pullulan, das aus Maltotriose-Einheiten besteht, die durch α-1,6-glykosidische Bindungen verbunden sind. Alle Enzyme waren auf Glykogen aktiv (Tabelle 1 und erweiterte Daten, Abb. 3). Interessanterweise behielten Mutanten des G. vaginalis-Enzyms, bei denen eine der beiden Amylasedomänen inaktiviert war, nur 5 % der Wildtyp-Aktivität bei, was darauf hindeutet, dass die beiden Domänen möglicherweise synergistisch wirken (Extended Data, Abb. 4). Alle Enzyme waren auf Pullulan aktiv, was darauf hindeutet, dass sie α-1,6-glykosidische Bindungen spalten, unterschieden sich jedoch in ihrer Aktivität gegenüber den α-1,4-glykosidischen Bindungen in Amylose bei L. Crispatus, L. iners, G. vaginalis und P. bivia GH13-Enzyme zeigten Aktivität, während M. mulieris- und P. bivia PulA-Enzyme inaktiv waren (Tabelle 1 und erweiterte Daten Abb. 3).

Die gemessenen kinetischen Parameter dieser GDEs stimmten weitgehend mit denen anderer bakterieller Enzyme überein, die diese Substrate verarbeiten (Glykogen36,37,38, Amylose39,40, Pullulan39,41). Der Vergleich der Spezifitätskonstanten (kcat/Km) für jedes Substrat ergab, dass Glykogen das bevorzugte Substrat für die Enzyme G. vaginalis und L. iners ist. Das PulA von L. Crispatus hatte ähnliche Spezifitätskonstanten für Pullulan und Glykogen mit Aktivität gegenüber Amylose. P. bivia PulA und M. mulieris PulA hatten höhere Spezifitätskonstanten für Pullulan im Vergleich zu Glykogen und Amylose, während das P. bivia GH13-Enzym Amylose bevorzugte (Tabelle 1 und erweiterte Daten Abb. 3). Insgesamt unterschieden sich diese Enzyme in ihrer Substratpräferenz, obwohl sie eine Homologie mit L. Crispatus PulA hatten.

Lactobacillus-dominante CSTs sind typischerweise mit einem niedrigen vaginalen pH-Wert (<4,5)42 aufgrund der Produktion von Milchsäure verbunden14. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass sich GDEs aus Laktobazillen möglicherweise so entwickelt haben, dass sie ihre Aktivität bei einem niedrigeren pH-Wert aufrechterhalten als die GDEs anderer Vaginalbakterien. Wir haben die GDE-Aktivität auf Glykogen über einen pH-Bereich von 2,5–8,0 gemessen (Abb. 2). Fünf der GDEs zeigten eine maximale Aktivität zwischen pH 5,5 und 6,0, was mit anderen charakterisierten bakteriellen Pullulanasen und Amylopullulanasen übereinstimmt43. P. bivia PulA zeigte maximale Aktivität bei einem etwas niedrigeren pH-Wert zwischen 4,5 und 5 (Abb. 2). Die meisten Enzyme vaginaler Anaerobier – G. vaginalis PulA, M. mulieris PulA und P. bivia GH13 – zeigten bei pH 4,0 fast keine Aktivität. Entscheidend ist jedoch, dass die PulAs von L. Crispatus, L. iners und P. bivia 34 %, 51 % und 97 % ihrer maximalen Aktivität bei pH 4,0 zeigten, was darauf hindeutet, dass sie besser an eine Umgebung mit niedrigem pH-Wert angepasst sind. Diese Aktivität könnte erklären, wie vaginale Laktobazillen unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert vom Wirt stammendes Glykogen nutzen können, was möglicherweise zu ihrer Dominanz beiträgt.

pH-Profile von sechs extrazellulären Glykogen abbauenden Enzymen. Puffersysteme bestanden aus Glycin (pH = 2,5–3,3), Natriumacetat (pH = 4,0–5,5), MES (pH = 6,0–6,5) und HEPES (pH = 7,0–8,0). Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente über 2 Tage (n = 3).

Quelldaten

Als nächstes versuchten wir, die spezifischen Oligosaccharidprodukte jedes Enzyms zu charakterisieren und zu quantifizieren (Abb. 3). Sowohl menschliche Amylase als auch P. bivia GH13 produzierten überwiegend Glucosedisaccharide (G2) und eine kleine Menge Glucose (G1) aus Glykogen und Amylose. Im Gegensatz dazu produzierten die als Typ-I-Pullulanasen bezeichneten Enzyme zusätzlich zu G2 längere Oligosaccharide, einschließlich Glucosetrisaccharide (G3) und in einigen Fällen Glucosetetrasaccharide (G4). Diese Ergebnisse ähneln denen, die für zuvor charakterisierte bakterielle Amylopullulanse beobachtet wurden44,45. G4 wurde in Tests mit G. vaginalis PulA nicht nachgewiesen und wurde in Tests mit den Enzymen M. mulieris und P. bivia nur in geringer Menge nachgewiesen. Allerdings produzierten die von Lactobacillus abgeleiteten PulA-Enzyme eine höhere relative Menge an G4, wenn sie auf Amylose oder Glykogen einwirkten. Während der Inkubation mit Pullulan produzierten alle bakteriellen Enzyme überwiegend G3, wohingegen die menschliche Speichelamylase inaktiv war. Die einzige Produktion von G3 ist bei Pullulan-abbauenden Enzymen üblich41,43,44,46. Bemerkenswert ist, dass die Pullulanase-Aktivität offenbar nur bei vaginalen bakteriellen GDEs auftritt und vom menschlichen Enzym nicht gezeigt wird (Tabelle 1 und Abb. 3).

Polymerabbauprodukte, die nach Inkubation über Nacht mit gereinigtem Enzym entstehen. Die LC-MS-Analyse ist repräsentativ für drei unabhängige Experimente, die über einen Zeitraum von 3 Tagen (n = 3) durchgeführt wurden. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert dar. G1, Glukose; G2, Maltose und Isomere; G3, Maltotriose und Isomere; G4, Maltotetraose und Isomere; G5, Maltopentaose und Isomere.

Quelldaten

Die spezifischen G3-Produkte des Pullulan-Abbaus wurden mittels Dünnschichtchromatographie (TLC) identifiziert. Jedes Enzym außer P. bivia GH13 produzierte Maltotriose, was ihre Fähigkeit bestätigt, α-1,6-glykosidische Bindungen zu spalten. P. bivia GH13 produzierte Panose, was darauf hindeutet, dass dieses Enzym nur α-1,4-glycosidische Bindungen in Pullulan spaltet (Extended Data Abb. 5). Diese Daten, gepaart mit den kinetischen Analysen (Tabelle 1), zeigen, dass sowohl Lactobacillus PulA-Enzyme als auch das G. vaginalis PulA-Enzym die im Glykogen vorkommenden α-1,4- und α-1,6-glykosidischen Bindungen spalten und deren Neuzuordnung unterstützen können als Typ-II-Pullulanasen oder Amylopullulanasen (EC. 3.2.1.1/41, besprochen in Lit. 45). P. bivia GH13 spaltet nur α-1,4-glykosidische Bindungen (auch innerhalb von Pullulan), was dieses Enzym als Pullulanhydrolase Typ I oder Neopullulanase identifiziert (EC 3.2.1.135, Übersicht in Lit. 47). Im Gegensatz dazu identifiziert die mangelnde Aktivität der PulA-Enzyme von M. mulieris und P. bivia gegenüber Amylose sie als Typ-I-Pullulanasen (EC 3.2.1.41) und erklärt möglicherweise ihre verringerte Fähigkeit, das Wachstum von L. Crispatus auf Glykogen zu ergänzen (Abb. 1d). und 3, Tabelle 1 und erweiterte Daten Abb. 5).

Angesichts ihrer Rolle bei der Ermöglichung des Wachstums auf Glykogen und der biochemischen Unterschiede zwischen verschiedenen GDEs stellten wir die Hypothese auf, dass diese Enzyme Ziele für mögliche therapeutische Interventionen sein könnten, die auf den Aufbau einer Lactobacillus-dominanten Gemeinschaft abzielen. Von vier klinisch verwendeten Amylase-Inhibitoren zeigten nur Acarbose und Acarviosin irgendeine Aktivität gegenüber den GDEs (Extended Data Abb. 6a). Acarbose inhibierte die Enzyme G. vaginalis PulA, P. bivia PulA und P. bivia GH13 mit halbmaximalen Hemmkonzentrationswerten (IC50) von 120 ± 30 μΜ, 420 ± 90 μΜ bzw. 0,84 ± 0,05 μΜ, während die L. Crispatus-, L. iners- und M. mulieris-Enzyme blieben weitgehend unbeeinflusst (Extended Data Abb. 6b).

Da Acarbose GDEs von CST IV-assoziierten Mikroben selektiv hemmte, haben wir seine Wirkung auf das Bakterienwachstum als ersten Schritt zur Prüfung seiner Nützlichkeit für die Modulation der Gemeinschaft charakterisiert. Während Acarbose das Wachstum von G. vaginalis auf Glykogen (IC50 = 0,2 μM) hemmte, hemmte es auch das Wachstum von L. Crispatus auf Maltose (IC50 = 22 μM) und Glykogen (IC50 = 0,1 μM), obwohl L. Crispatus PulA in vitro nicht beeinträchtigt wurde . Interessanterweise wurde das Wachstum von L. Crispatus nicht beeinträchtigt, wenn Glukose die primäre Kohlenstoffquelle war (Extended Data Abb. 6c). Diese Daten legen nahe, dass Acarbose zusätzliche L. Crispatus-Enzyme hemmt, die am Maltodextrin-Metabolismus beteiligt sind. Trotz der starken Hemmung von P. bivia GH13 in vitro hatte Acarbose keinen Einfluss auf das Wachstum von P. bivia auf irgendeinem Substrat (Extended Data Abb. 6c). Dies legt nahe, dass PulA von P. bivia, das in vitro weniger anfällig für Hemmung war, wahrscheinlich das vorherrschende GDE in diesem Organismus ist und dass der intrazelluläre Maltodextrin-Katabolismus in P. bivia durch Acarbose nicht beeinflusst wird. Obwohl Acarbose aufgrund seines breiten Zielspektrums insgesamt kein geeigneter Kandidat für die Community-Modulation ist, verdeutlichen diese Ergebnisse Unterschiede zwischen den GDEs, die möglicherweise für eine selektive Hemmung ins Visier genommen werden könnten.

Nachdem wir echte vaginale bakterielle GDEs identifiziert hatten, versuchten wir als Nächstes, das Vorhandensein und die Expression von Genen zu verstehen, die diese Enzyme in der Vaginalumgebung kodieren. Während bei anderen Recherchen mutmaßliche bakterielle Amylasen in klinischen Proben mittels Proteomik21, Metagenomik und Metatranskriptomik23,48 entdeckt wurden, wurden die Aktivitäten dieser Enzyme nicht biochemisch verifiziert. Wir verwendeten shortBRED (Short, Better Representative Extract Dataset), um biochemisch charakterisierte GDEs in einem Datensatz von 178 gepaarten vaginalen Metagenomen und Metatranskriptomen von 40 nicht schwangeren Frauen im gebärfähigen Alter zu identifizieren, die über einen Zeitraum von 10 Wochen selbst Vaginalabstriche gesammelt hatten48,49. ShortBRED ist ein Rechentool, das einzigartige Aminosäuresequenzen identifiziert und quantifiziert, die sich von einem Abfrageprotein unterscheiden (85 % Identitätsgrenze). Im Gegensatz zu früheren Studien wird vorhergesagt, dass alle abgefragten Enzyme extrazellulär sind und Glykogen in vitro abbauen, was die Gewissheit erhöht, dass alle Treffer auch über diese Aktivität verfügen.

Kombinierte Lesevorgänge der sechs GDEs waren in CST I-Metagenomen häufiger als in CST II- und CST IV-Metagenomen (Abb. 4a). Diese erhöhte Häufigkeit in CST I-Proben ist auf L. Crispatus pulA (Abb. 4b) zurückzuführen, das in 84,6 % der Metagenome und 89,7 % der Metatraskriptome von CST I-Teilnehmern nachgewiesen wurde. M. mulieris pulA wurde bei diesen Personen nicht nachgewiesen und die anderen vier GDEs wurden in weniger als 11 % der Metagenome und Metatranskriptome nachgewiesen (Extended Data Abb. 7). In CST III-Proben, die von L. iners dominiert wurden, wurde L. iners pulA in 41,9 % bzw. 32,3 % der Metagenome und Metatranskriptome nachgewiesen. Interessanterweise wurden Gene, die für andere GDEs (L. Crispatus PulA, G. vaginalis PulA, beide P. bivia GDEs) kodieren, in >20 % der CST III-Metagenome nachgewiesen. Der Nachweis dieser Gene in den Metatranskriptomen war jedoch sehr unterschiedlich (6,45 %–38,7 %).

a, Metagenomische Analyse von 178 Teilnehmerproben mittels ShortBRED-Analyse biochemisch charakterisierter GDEs, stratifiziert nach CST. Es wurden nur Proben aufgetragen, die für eine bakterielle GDE kodierten. % Kodierung stellt den Prozentsatz der Proben dar, die >0 Gene pro Bakteriengenom enthalten. Eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen (Dunnett) wurde durchgeführt, um statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zur CST I-Häufigkeit zu bestimmen (CST IV, ****P < 0,0001; CST V, *P = 0,0196; NSP > 0,05). Die Box stellt dar Das 1,5-fache des Interquartilbereichs und die Whisker stellen das Minimum bis zum Maximum des Datensatzes dar. Die Mittellinie bezeichnet den Median. b, Wärmekarte der metagenomischen Präsenz und Häufigkeit, die mit ShortBRED in jeder Probe erkannt wurde. NP, nicht vorhanden. c: Die ABPP-Analyse identifiziert bakterielle GDEs und menschliche Proteine ​​(α-Amylase und GAA) in CVF-Überständen. ND, nicht erkannt; GAA, lysosomale α-Glucosidase. d, Humanes CVF enthält bei pH 5,5 deutlich bakterielle Pullulanase-Aktivität. Die Daten sind repräsentativ für drei experimentelle Wiederholungen über 2 Tage und die Fehlerbalken liegen eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert. Eine einfaktorielle ANOVA mit mehreren Vergleichen (Dunnett) wurde durchgeführt, um statistisch signifikante Unterschiede im Vergleich zur Probe ohne CVF (blau) zu bestimmen (S003, ****P < 0,0001; S011, ****P < 0,0001).

Quelldaten

Alle GDEs wurden in CST IV-Metagenomen mit einer Häufigkeit von 16,9 %–36,1 % nachgewiesen. Während L. Crispatus pulA in 39,8 % der CST IV-Metatranskriptome nachgewiesen wurde, wurden Transkripte von anderen GDEs nur in 3,6 %–10,8 % der Datensätze nachgewiesen (Extended Data Abb. 7). Insgesamt zeigt diese Analyse, dass charakterisierte bakterielle GDEs in vaginalen Metagenomen vorhanden sind und in verschiedenen vaginalen bakteriellen CSTs exprimiert werden, wobei insbesondere CST III- und CST IV-Gemeinschaften GDEs mehrerer Arten beherbergen.

Als nächstes versuchten wir, die Aktivität von bakteriellen GDEs und menschlicher Amylase in klinischen Proben nachzuweisen. Wir analysierten zunächst 20 CVL-Probenüberstände mit einem Nugent-Score-Bereich (0–8) und verglichen die Gesamtamylaseaktivität mit der Konzentration menschlicher Amylase, die durch einen Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) bestimmt wurde (ergänzende Abbildung 2 und erweiterte Daten, Abbildung 8). ). Aktivitätstests mit einem fluoreszierenden Stärkesubstrat wurden über einen pH-Bereich hinweg durchgeführt, der von der gesunden Vaginalumgebung (4,4) bis zum Optimum für die menschliche Amylase (6,8) reichte. Bei allen pH-Werten gab es eine statistisch signifikante Korrelation zwischen diesen Messungen (Extended Data Abb. 8), was darauf hindeutet, dass der Großteil der Amylaseaktivität menschlich ist. Es ist jedoch interessant festzustellen, dass mit abnehmendem pH-Wert der Korrelationskoeffizient verringert wurde, was möglicherweise auf einen erhöhten Beitrag anderer Enzyme bei niedrigerem pH-Wert hindeutet (Erweiterte Daten, Abb. 8). Beim Vergleich dieser Ergebnisse mit den Nugent-Scores (niedriger Nugent 0–3, hoher Nugent 7–10) stellten wir keinen Unterschied in der Amylaseaktivität oder den menschlichen Amylasespiegeln fest (ergänzende Abbildung 3). Um die Spezifität des ELISA für das menschliche Enzym zu bestätigen, haben wir unsere gereinigten bakteriellen Enzyme mit demselben Kit getestet und keine Kreuzreaktivität bei Enzymkonzentrationen von bis zu 1 μM festgestellt (ergänzende Abbildung 2). Zusammenfassend deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Beitrag der menschlichen Amylase zum Glykogenabbau trotz der Existenz bakterieller Enzyme mit verwandten Aktivitäten nicht übersehen werden sollte.

Als nächstes versuchten wir festzustellen, ob bakterielle GDEs in CVF-Proben aktiv waren, indem wir ein aktivitätsbasiertes Proteinprofiling (ABPP)50 unter Verwendung von Sonden anwendeten, die auf die Enzyme Amylase (Amy-ABP) und Glucosidase (Glc-ABP) abzielen. Nachdem bestätigt wurde, dass die gereinigten bakteriellen GDEs mit mindestens einer Sonde reagierten (Ergänzende Abbildungen 4 und 5), wurden CVF-Überstände mit Biotin-markierten Sonden markiert, gefolgt von Pulldown, tryptischem Verdau und Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS). /MS) Identifizierung der Peptide. Die Amy-ABP-Sonde identifizierte L. Crispatus PulA, L. iners PulA und G. vaginalis AmyA in diesen Proben (Abb. 4c und erweiterte Daten Abb. 9). L. Crispatus PulA und L. iners PulA schlossen sich gegenseitig aus, was mit früheren Studien übereinstimmt, in denen festgestellt wurde, dass ihr gleichzeitiges Auftreten ungewöhnlich ist7. In einer Probe (S004) beobachteten wir das gleichzeitige Auftreten von zwei bakteriellen Enzymen: L. iners PulA und G. vaginalis AmyA. Obwohl wir G. vaginalis AmyA in dieser Studie nicht charakterisierten (aufgrund seiner geringen Aminosäureähnlichkeit mit L. Crispatus PulA), wurde kürzlich gezeigt, dass es Glykogen abbaut51. In den meisten Proben haben wir auch menschliche α-Amylase (AMY1) nachgewiesen (Abb. 4c und erweiterte Daten Abb. 9). Im Gegensatz zu den Amy-ABP-angereicherten Proteinen waren alle Glc-ABP-angereicherten Proteine ​​menschlichen Ursprungs. Das Protein mit der höchsten Intensität war lysosomale α-Glucosidase, die kanonisch im Lysosom lokalisiert ist, aber bereits zuvor in CVF nachgewiesen wurde (Abb. 4c, erweiterte Daten Abb. 9 und Ergänzungsdatei 1) 52, 53, 54. Insgesamt zeigen diese Daten, dass bakterielle GDEs in der vaginalen Umgebung vorhanden und aktiv sind, darunter L. Crispatus PulA, L. iners PulA und G. Vaginalis AmyA.

Um die Aktivität bakterieller GDEs in diesen Proben weiter zu validieren, verwendeten wir einen LC-MS-basierten Assay zum Nachweis des Pullulanabbaus und nutzten dabei die Beobachtung, dass alle charakterisierten GDEs Pullulan metabolisieren, die menschliche Amylase hingegen nicht (Abb. 3). Jede CVF-Probe zeigte in diesem Test Aktivität (Extended Data Abb. 10). Bemerkenswert ist, dass die beiden aktivsten Proben, S003 und S011, im ABPP-Experiment die höchste Intensität von L. Crispatus PulA aufwiesen (Abb. 4c) und im Vergleich zu einer Kontrolle ohne CVF signifikant erhöhte G3-Spiegel erzeugten (Abb. 4d). Diese Ergebnisse zeigen weiter, dass vaginale bakterielle GDEs in klinischen Proben aktiv sind und validieren einen einfachen, zugänglichen Test für bakterielle GDEs, der nicht von proteomischen Arbeitsabläufen abhängt.

In dieser Studie haben wir sechs GDEs aus Vaginalbakterien biochemisch charakterisiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass einige Vaginalbakterien nicht nur auf menschliche Amylase angewiesen sind, sondern auch über alternative Enzyme für den Zugriff auf Glykogen verfügen. Diese Ergebnisse werden durch einen separaten Bericht über die glykogenabbauende Aktivität von L. Crispatus PulA (GlgU, 99 % Identität) weiter bestätigt55. Entscheidend ist, dass wir trotz einer gemeinsamen Anmerkung feststellen, dass die Substratpräferenzen und Abbauprodukte bakterieller GDEs recht unterschiedlich sind. Dies steht im Einklang mit den einzigartigen Kohlenhydratbindungsmodulen, die in jedem Protein vorkommen, und könnte auf eine Anpassung hindeuten, um strukturell unterschiedliche Glukosepolymere in der Vaginalumgebung zu verarbeiten. Da die beim Abbau von Glykogen entstehenden Oligosaccharide extrazellulär freigesetzt werden und möglicherweise als „öffentliche Güter“56 fungieren, könnten die Unterschiede in der Produktverteilung dieser Enzyme darüber hinaus darauf hindeuten, dass die unterschiedliche Verfügbarkeit von aus Glykogen gewonnenen Oligosacchariden zwischen CSTs das Wachstum verschiedener nicht- Glykogen abbauende Bakterien durch Kreuzfütterung11. Um diese Möglichkeit weiter bewerten zu können, ist ein besseres Verständnis der Struktur von Glykogen in der Vaginalumgebung und der Frage, ob sie sich zwischen CSTs unterscheidet, erforderlich.

Unsere Arbeit legt auch einen möglichen Mechanismus nahe, der das Wachstum und die Dominanz von L. Crispatus unterstützt. Insbesondere haben wir herausgefunden, dass L. Crispatus PulA bei niedrigen pH-Werten (~3,5–4) aktiv ist, die mit der vaginalen Gesundheit verbunden sind. Diese enzymatische Aktivität ermöglicht L. Crispatus daher möglicherweise den Zugriff auf Glykogen unter Bedingungen, bei denen die menschliche Amylase minimal aktiv ist und das Wachstum konkurrierender Bakterien gehemmt wird. Entscheidend ist, dass die pH-Profile, Substratpräferenzen und Abbauprodukte von Amylasen anhand der Primärsequenzanalyse nicht vorhergesagt werden können, was die Notwendigkeit einer biochemischen Charakterisierung zur Unterstützung bioinformatischer Untersuchungen des bakteriellen Stoffwechsels im menschlichen Mikrobiom weiter unterstreicht.

Die hohe Prävalenz von L. Crispatus PulA in CST-I-Metagenomen (85 %) lässt zudem auf eine wichtige Rolle dieses Enzyms schließen. Bemerkenswert ist, dass in den von L. iners dominierten CST III-Proben das homologe PulA-Enzym viel seltener vorkommt (42 %), was möglicherweise darauf hindeutet, dass L. iners weniger auf Glykogen angewiesen ist oder stärker auf andere Enzyme angewiesen ist. Darüber hinaus wurde für L. gasseri oder L. jensennii nie über einen Glykogenabbau berichtet und wir fanden keine in ihren Genomen kodierten PulA-Homologen, was offene Fragen zum Glykogenstoffwechsel in CST II und V offen lässt.

Eine große Herausforderung bei der Charakterisierung des Glykogenstoffwechsels in klinischen Proben ergab sich aus der Schwierigkeit, zwischen menschlicher und bakterieller Amylaseaktivität zu unterscheiden21. Unser Einsatz von ABPP identifiziert aktive Enzyme in diesen komplexen Proben kategorisch. Darüber hinaus identifiziert unser einfacher LC-MS-basierter Assay für Pullulanase-Aktivität schnell die bakterielle GDE-Aktivität. Unsere Ergebnisse und die Ergebnisse anderer neuerer Bemühungen17,21 zeigen, dass die bakterielle GDE-Aktivität sehr unterschiedlich ist, was die Notwendigkeit unterstreicht, eine größere Anzahl besser charakterisierter klinischer Proben zu testen. Wir gehen davon aus, dass der Pullulanase-Aktivitätstest bei der Analyse solcher Proben breite Anwendung finden und weitere Untersuchungen der biologischen Rolle bakterieller GDEs ermöglichen wird57.

Insgesamt unterstreichen die aus dieser Untersuchung gewonnenen Erkenntnisse die Notwendigkeit, die bioinformatische Analyse durch eine detaillierte biochemische Charakterisierung vaginaler bakterieller Enzyme zu ergänzen. Dieses verbesserte Verständnis der Aktivitäten vaginaler bakterieller GDEs wird die zukünftige Erforschung des bakteriellen Glykogenstoffwechsels im vaginalen Mikrobiom und seines Beitrags zur Zusammensetzung, Stabilität und Dysbiose der Gemeinschaft ermöglichen.

Diese Arbeit entsprach allen relevanten ethischen Vorschriften und wir haben die Einverständniserklärung aller Spender eingeholt. Die Studienprotokolle wurden vom Massachusetts General Hospital (IRB: 2014P001066) und den Seattle University Affiliates (IRB: FY2022‐002) genehmigt.

Homologe von PulA in L. Crispatus22 (EEU28204.2) wurden durch BLASTp-Suchen von Genomen aus vaginalen Isolaten in der IMG-Datenbank58 unter Verwendung eines E-Wert-Grenzwerts von 1 × 10–5 identifiziert. Die IMG-Datenbank enthält 151 vaginale Isolatgenome aus dem Human Microbiome Project mit der Beispielkörperunterseite „vaginal“ (Ergänzungsdatei 1). Treffer ohne vorhergesagtes Signalpeptid wurden entfernt (SignalP v.5.0 (Lit. 59)). Es wurden sechs Kandidaten mit einer Aminosäureidentität von >35 % aus Mikroben ausgewählt, die mit Gesundheit oder Krankheit assoziiert sind. Genomische DNA wurde aus den kodierenden Stämmen mit einem mikrobiellen DNeasy UltraClean-Kit (Qiagen) extrahiert. Die Gene wurden durch PCR unter Entfernung des Signalpeptids amplifiziert (ergänzende Abbildung 1) und über Gibson-Assemblierung in den E. coli-Expressionsvektor pET28a (Novagen) kloniert, um ein N-terminales His6-markiertes Gen zu erzeugen. Anschließend wurden die Plasmide zur Expression und Reinigung in den Expressionswirt BL21 (DE3) (P. bivia-Enzyme) oder ArcticExpress (DE3) (alle anderen Enzyme) transformiert. Vollständige Listen der Plasmide und Primer finden Sie in der Ergänzungstabelle 2 bzw. der Ergänzungsdatei 1.

Kulturen, die Expressionsplasmide enthielten, wurden in LB-Medium mit 50 μg ml-1 Kanamycin auf eine optische Dichte bei 600 nm (OD600) von 0,6–0,8 gezüchtet, dann auf 15 °C abgekühlt und mit 250 μM Isopropyl-β-D-1-Thiogalactopyranosid induziert ( IPTG). Nach 16 Stunden bei 15 °C wurden die Zellen gesammelt und die Pellets bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Pellets wurden in 98 % Puffer A (50 mM HEPES, 300 mM KCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) resuspendiert und mit 2 % Puffer B (50 mM HEPES, 300 mM KCl, 10 % Glycerin, 500 mM Imidazol, pH 7,8) ergänzt mit EDTA-freiem Protease-Inhibitor-Cocktail (Sigma). Die Zellen wurden durch Homogenisierung (3 × 15.000 psi, Emulsiflex-C3, Avestin) lysiert und die Lysate geklärt (16.000 × g für 45 Minuten bei 4 °C), bevor sie auf eine 5-ml-HisTrap-Säule (GE Healthcare) geladen wurden. Darauf folgten ein Säulenvolumen (CV) mit 2 % Puffer B und 2 CV mit 10 % Puffer B. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 10 bis 100 % Puffer B über 20 CV eluiert. Proteinhaltige Fraktionen und Reinheit wurden durch bestimmt SDS–SEITE. Amylasehaltige Fraktionen wurden gepoolt, in einem Spin-Konzentrator (Millipore) auf ein Volumen von ~1 ml konzentriert und durch Größenausschlusschromatographie (GE Healthcare, Superdex 200) in 100 % Puffer A gereinigt.

Die Fraktionen wurden erneut mittels SDS-PAGE analysiert und proteinhaltige Fraktionen gepoolt, konzentriert (Millipore, Amicon 30 kDa), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Proteinkonzentration wurde mithilfe eines Bradford-Assays bestimmt.

Glucosehaltige MRS-Brühe (BD Difco) wurde gemäß dem Herstellerprotokoll hergestellt. Für Wachstumstests an verschiedenen Kohlenstoffquellen wurde MRS-Brühe ohne Glucose (Food Check Systems, pH 6,5–6,6) gemäß der Rezeptur des Herstellers hergestellt und entweder mit 2 % D-Glucose (Sigma), 2 % Maltose-Monohydrat (VWR) oder ergänzt 5 % Glykogen aus Auster (Sigma). Jeder Mediumtyp wurde filtersterilisiert (0,2 μm) und zur Äquilibrierung über Nacht in einer anaeroben Kammer mit einer Atmosphäre aus 2,5 % H2, 5 % CO2 und 92,5 % N2 (Coy Labs) belassen. Starterkulturen von L. Crispatus C0176A1 und L. Crispatus MV-1A-US wurden in Hungate-Röhrchen in MRS-Medium (BD Difco) inokuliert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das gereinigte Protein aufgetaut und bis zu einer Konzentration zwischen 200 und 400 nM zu 5 % Glykogen-MRS-Medium gegeben. Das Medium wurde vor der Verwendung erneut filtersterilisiert. Als Negativkontrolle wurde 15 Minuten lang bei 100 °C gekochtes Protein mitgeführt. Von jedem Mediumtyp wurden 50 μl in eine mit Gewebekultur behandelte klare Mikroplatte mit 384 Vertiefungen (Corning) aliquotiert. Zur Beimpfung jeder Vertiefung wurde eine Übernachtkultur (1 μl) verwendet. Die Platte wurde versiegelt und das Wachstum wurde in einem Plattenlesegerät (Biotek) in einer anaeroben Kammer (Coy Labs) bei 37 °C 24 Stunden lang durch Messung der OD600 alle 15 Minuten überwacht.

Die kinetische Analyse von GDEs wurde unter Verwendung eines Tests auf reduzierenden Zucker41 durchgeführt, der für ein 96-Well-Format modifiziert wurde. Es wurden Reaktionen (300 μl) mit Substrat (0,0048–10 mg ml-1 Glykogen; 0,0012–1,25 mg ml-1 Pullulan (Megazyme) oder 0,0048–1,25 mg ml-1 Amylose in einer Endkonzentration von 2 % Dimethylsulfoxid angesetzt ), 0,8–700 nM Enzym und Reaktionspuffer (20 mM Natriumacetat, pH 5,5, 0,5 mM CaCl2). Die Reaktionsgemische wurden 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und 50-μl-Aliquots wurden entnommen (2, 5, 7,5, 10, 15 Minuten) und in 125 μl der BCA-Stopplösung (0,4 M Natriumcarbonat, pH 10,7, 2,5 mM CuSO4, 2,5 mM 4,4'-Dicarboxy-1,2'-bichinolin, 6 mM L-Serin). Nach 30-minütiger Inkubation bei 80 °C wurden die Absorptionen bei 540 nm abgelesen und mit einer Maltose-Standardkurve (0,000610–0,625 mg ml−1) verglichen, um die Aktivität zu quantifizieren. Die Anfangsgeschwindigkeiten wurden mittels linearer Regression berechnet, wobei die Datenpunkte ausgewählt wurden, die die höchste Anfangsgeschwindigkeit erzeugten, wobei mindestens drei Datenpunkte verwendet wurden. Die KM- und kcat-Parameter wurden durch Anpassen der Michaelis-Menten-Gleichung mithilfe einer nichtlinearen Regression (Graphpad Prism 8) bestimmt.

Ein 1-μl-Volumen der GDE-Reaktionsmischungen wurde auf eine TLC-Platte getupft und etwa 5 Stunden lang in 3:2:1 Butanol:Essigsäure:Wasser laufen gelassen. Die Platte wurde entfernt, 10 Minuten lang mit einer Heißluftpistole getrocknet und mit einer 1:19 Schwefelsäure:Ethanol-Lösung besprüht. Die Platte wurde durch 15-minütiges Erhitzen mit einer Heißluftpistole entwickelt, bis Flecken auftraten. Die Identität der Produkte wurde durch mitlaufende reine Standards bestätigt.

Die Reaktionen wurden unter Verwendung des reduzierenden Zuckertests (siehe oben) mit 1,25 mg ml-1 Glykogen, 0,9–850 nM Enzym und Testpuffer im pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 (pH 2,5–3,3: 20 mM Glycin, 0,5 mM CaCl2; pH) durchgeführt 4,0–5,5: 20 mM Natriumacetat, 0,5 mM CaCl2; pH 6,0–6,5: 20 mM MES, 0,5 mM CaCl2; pH 7,0–8,0: 20 mM HEPES, 0,5 mM CaCl2). G. vaginalis PulA-Mutanten des aktiven Zentrums wurden unter Verwendung einer Multifragment-Gibson-Anordnung konstruiert, die aus dem Wildtyp-Expressionsvektor pETpullGV unter Verwendung der in der Ergänzungsdatei 1 aufgeführten Primer amplifiziert wurde. pETpullGV-AS1 (∆AS1) und pETpullGV-AS2 (∆AS2) enthielten ein D233A bzw. D1317A-Mutation, die das katalytische Aspartat der Amylasedomänen dieser Proteine ​​inaktivieren soll. pETpullGV-DM (∆DBL) enthielt beide Mutationen. Spezifische Aktivitäten von Mutanten des aktiven Zentrums von G. vaginalis PulA wurden bei pH 5,5 bestimmt.

Es wurden Reaktionen mit 10 mg ml-1 Substrat und 500 nM Enzym angesetzt, alle in Reaktionspuffer gelöst und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Proben wurden durch 10-fache Verdünnung in 90 % Acetonitril gequencht. Die Platten wurden zentrifugiert (3.220 × g für 10 Minuten, 4 °C) und die Proben wurden vor der Analyse durch UHPLC-MS unter Verwendung eines Xevo TQ-S (Waters) mit Elektrospray-Ionisation (ESI) 1.000-fach in Acetonitril verdünnt. Die Probe (5 μl) wurde auf eine auf 40 °C erhitzte Acquity BEH/Amid UPLC-Säule (Waters, 1,7 μm, 130 Å, 2,1 mm × 50 mm) injiziert. Es wurde eine Flussrate von 0,5 ml min−1 mit folgendem Gradienten verwendet: 0–1,0 min bei 97 % B (Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure) und 3 % A (H2O mit 0,1 % Ameisensäure), isokratisch, 1,0–4,0 min. 97–30 % B, 4,0–5,0 Min. bei 30 % B isokratisch, 5,0–5,1 Min. bei 30–97 % B, 5,1–7,0 Min. bei 97 % B isokratisch. Kohlenhydratprodukte wurden durch ESI im positiven Modus nachgewiesen (Kapillarspannung 3,10 kV; Kegelspannung 42 V; Quellenoffsetspannung 50 V; Desolvatisierungstemperatur 500 °C; Desolvatisierungsgasfluss 1.000 l·h−1; Kegelgasfluss 150 l·h−1; Zerstäuber 7,0). Bar). Siehe Ergänzende Informationen zu verbindungsspezifischen Nachweisparametern (Ergänzungstabelle 3). Zur Quantifizierung der Oligosaccharide und ihrer Isomere wurden Standards für Glucose, Maltose (VWR), Maltotriose (Carbosynth), Maltotetraose (Carbosynth) und Maltopentaose (Carbosynth) im Bereich von 0,001–10 μg ml−1 in 9:1 Acetonitril:Wasser hergestellt . Oligosaccharid-Peakflächen wurden unter Verwendung der Standardkurve quantifiziert und die Daten wurden auf eine Kontrolle ohne Enzyme normalisiert, um den nichtenzymatischen Substratabbau zu berücksichtigen (Waters MassLynx).

Wachstumshemmungstests wurden in einer anaeroben Kammer (Coy Labs) mit einer Atmosphäre aus 2,5 % H2, 5 % CO2 und 92,5 N2 durchgeführt. Bakterien wurden aus einzelnen Kolonien in eine Pepton-Hefeextrakt-Basisbrühe (PYTs, pH 7,0–7,2) geimpft, die aus Proteosepepton (20 g l−1), Hefeextrakt (10 g l−1), MgSO4 (0,008 g l−1) und K2HPO4 (0,04 g l−1), KH2PO4 (0,04 g l−1), NaHCO3 (0,4 g l−1), Vitamin K (0,0025 g l−1), Hämin (0,005 g l−1), L-Cystein • HCl (0,25 g l−1). −1), Tween 80 (0,25 ml l−1), Pferdeserum (50 ml l−1) und Glucose (2 g l−1) und bei 37 °C für ~24 Stunden inkubiert. Die Kulturen wurden auf eine OD600 von 0,4–0,5 eingestellt, mit einer 1:50-Verdünnung in frische PYTs (ohne Glucose) subkultiviert und mit den angegebenen Kohlenhydraten bis zu einer Endkonzentration von 2 g l−1 versetzt. Glykogen stammte aus Austern (Sigma, G8751). Die Tests wurden in zweifacher Ausfertigung in 384-Well-Platten, die mit gasdurchlässigen BreathEasy-Membranen (Diversified Biotech) versiegelt waren, unter anaeroben Bedingungen durchgeführt. Das Bakterienwachstum wurde durch Messung der OD600 in 1-Stunden-Intervallen über 48 Stunden in einem BioTek Epoch2-Plattenlesegerät überwacht. Die Daten wurden auf leere (nicht beimpfte) Medien normalisiert. Für Hemmungstests wurden Bakterien wie oben unter Zusatz von Acarbose in den angegebenen Konzentrationen kultiviert. Das Ausmaß der Hemmung wurde bestimmt, indem die OD600 für jede Behandlung auf eine unbehandelte Kontrolle zu dem Zeitpunkt normalisiert wurde, zu dem die Kontrolle die stationäre Phase erreichte. Anschließend wurden die IC50-Werte mithilfe der Regression der kleinsten Quadrate (GraphPad Prism 8) berechnet.

ShortBRED wurde verwendet, um die Häufigkeit der sechs biochemisch charakterisierten bakteriellen GDEs in zuvor sequenzierten vaginalen Metagenomen und Metatranskriptomen zu quantifizieren. Zunächst wurde ShortBRED-Identify verwendet, um Marker für alle 6 PulA-Sequenzen zu erstellen, wobei UniRef90 2017 als Referenzliste (Ergänzungsdatei 1) und eine Cluster-ID-Einstellung von 85 % verwendet wurden. Marker wurden in ShortBRED-Quantify verwendet, um die Häufigkeit von pulA-Genen und -Transkripten in gepaarten Metagenom- und Metatranskriptom-Datenbanken zu bestimmen (Bioproject PRJNA797778). Die zur Verarbeitung der Datensätze verwendeten Skripte wurden bereits beschrieben48. Die Ausgabe von ShortBRED-Quantify ist Lesevorgänge pro Million Lesevorgänge pro Kilobase Million (RPKM) und wurde unter Verwendung der durchschnittlichen Genomgrößen (AGS) jeder Metagenomprobe, berechnet mit MicrobeCensus60, auf Zählungen pro mikrobiellem Genom normalisiert. Wir haben die Ausgabe von ShortBRED mithilfe der zuvor abgeleiteten Gleichung (siehe unten) normalisiert61.

Beispielmetadaten wurden verwendet, um die Ergebnisse nach Community-Staatstyp zu gruppieren (CST I n = 39, CST II n = 16, CST III n = 31, CST IV n = 83, CST V n = 9). Der Anteil der Proben, die für ein bakterielles GDE-Gen in einem bestimmten CST positiv waren, wurde berechnet, indem die Anzahl der Proben, die einen Treffer enthielten (Werte > 0), durch die Gesamtzahl der Proben mit dem entsprechenden CST dividiert wurde.

CVLs wurden von Dr. Caroline Mitchell am Massachusetts General Hospital erhalten (IRB: 2014P001066). Alle mit dieser Kohorte verbundenen Metadaten werden gemeldet (Ergänzungsdatei 1). CVLs wurden mit 3 ml steriler Kochsalzlösung gesammelt, mit einer Transferpipette über den Gebärmutterhals und die Vaginalwände gespült und dann erneut abgesaugt. Die Proben wurden zentrifugiert (10.000 × g für 10 Minuten bei 4 °C) und die Überstände wurden dekantiert und im Test verwendet. Gereinigte Proteine ​​wurden in Puffer A (50 mM HEPES, 300 mM KCl, 10 % Glycerin, pH 7,8) auf 1 μM verdünnt und dann im Assay verwendet. Menschliche Speichelamylase wurde von Sigma Aldrich (A1031-1KU) erworben. Humane Amylase wurde in CVLs mithilfe eines ELISA für humane Pankreas-Amylase (Abcam ab137969) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen.

Die Amylaseaktivität von CVL-Überständen wurde mit dem EnzCheck Ultra Amylase Assay Kit (Thermo Fisher, E33651) bestimmt. Das Substrat wurde gemäß den Kit-Anweisungen unter Verwendung von drei verschiedenen Puffern (20 mM Natriumacetat, 0,5 mM CaCl2, pH 4,4; 20 mM Natriumacetat, 0,5 mM CaCl2, pH 5,5; 20 mM MES, 0,5 mM CaCl2, pH 6,8) hergestellt. CVL-Überstand (10 μl) wurde in jede Vertiefung einer schwarzen 96-Well-Platte mit klarem Boden gegeben und dann mit 40 μl pH-eingestelltem Puffer verdünnt. Die Reaktionen wurden mit 50 μl Substrat gestartet und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Der pH-angepasste Puffer machte 90 % des Reaktionsvolumens aus und jedes Kit-Reagenz wurde im entsprechenden Puffer gelöst. Die Fluoreszenz wurde bei 485/528 nm gemessen. Die anfänglichen Raten wurden in der Plattenlesesoftware (Biotek) berechnet, indem die höchste Steigung bestimmt wurde, die mindestens 5 Datenpunkte abdeckte.

CVF-Proben wurden von verbundenen Unternehmen der Seattle University gesammelt (IRB: GJ2022-002). Die Teilnehmer erhielten für ihre Teilnahme an der Studie keine Vergütung. Alle Metadaten sind in den Zusatzinformationen (Ergänzungstabelle 4) aufgeführt. Die Spender sammelten selbst eine Probe, indem sie eine Soft Disc einführten und dann 1–4 Stunden warteten, bevor sie die Disc entfernten und in ein konisches 50-ml-Fläschchen gaben. Innerhalb einer Stunde nach der Sammlung wurde CVF durch Zugabe von 1 ml PBS und 8-minütige Zentrifugation bei 200 × g von der Scheibe entfernt. Die Proben wurden dann in 0,1-ml-Aliquoten bei –70 °C eingefroren.

Biotinylierte und fluoreszierende Sonden für α-Amylasen (CYR1114 bzw. CYR232)26 und α-Glucosidasen (JJB384 bzw. JJB383)62 wurden freundlicherweise von Dr. Hermann Overkleeft und Dr. Gideon Davies (Universität Leiden) zur Verfügung gestellt. Vor der Verwendung wurden CVF-Proben zentrifugiert (10.000 × g für 5 Minuten), um Muzine zu entfernen. CVF-Proben wurden mit sterilem PBS auf eine Proteinkonzentration (Bicinchoninsäure-Assay) von 1 mg ml normalisiert und mit EDTA-freiem Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) versetzt. Der CVF-Überstand wurde dann mit der fluoreszierenden Amylase-Sonde in einer Endkonzentration von 25 μM oder der fluoreszierenden Glucosidase-Sonde in einer Endkonzentration von 10 μM inkubiert. Negativkontrollen des Vehikels (1 % v/v Dimethylsulfoxid in Wasser) und Hitzeschockkontrollen wurden einbezogen, um Hintergrundfluoreszenz oder Off-Target-Markierung zu identifizieren. Die Proben wurden 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die Proteine ​​auf einem 4–20 %igen PAGE-Gel (Bio-Rad) aufgetrennt und die Sondenfluoreszenz sichtbar gemacht (Azure C600).

Aktive Amylasen wurden mit ABPP angereichert und wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen über LC-MS/MS identifiziert50. Der wie oben hergestellte CVF-Überstand wurde in drei 400-μl-Aliquots aufgeteilt. Biotinylierte Amylase-Sonde (Endkonzentration 25 μM), biotinylierte Glucosidase-Sonde (Endkonzentration 10 μM) oder ein gleiches Volumen Vehikel (1 % Dimethylsulfoxid in Wasser) wurden zugegeben und die Proben 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Markierung wurden 400 μl eiskaltes Methanol zugegeben und die Proben über Nacht bei –70 °C gelagert, um Proteine ​​auszufällen. Ausgefälltes Protein wurde durch Zentrifugation (10.000 × g für 10 Minuten) gesammelt, in 500 μl 1,2 % SDS in PBS wieder aufgelöst und 2 Minuten auf 95 °C erhitzt. Anschließend wurden die Proben zentrifugiert (14.000 × g für 5 Minuten), um unlösliche Proteine ​​zu entfernen.

Streptavidin-Agaroseharz (100 μl, Thermo Fisher) wurde durch Waschen mit 0,5 % w/v SDS in PBS (3×), 6 M Harnstoff in 25 mM NH4HCO3 (3×) und PBS (3×) unter Verwendung eines Vakuumverteilers hergestellt. Anschließend wurde gewaschenes Harz in 2 ml PBS zu den Proteinproben gegeben und die Proben 1 Stunde lang bei 37 °C rotierend inkubiert. Die Proben wurden dann auf Säulen (Bio-Rad Poly-Prep) auf einem Vakuumverteiler übertragen und mit 1 ml Volumina von 0,5 % w/v SDS in PBS (3x), 6 M Harnstoff in 25 mM NH4HCO3 (3x) und Reinstwasser (3×), PBS (9×) und 25 mM NH4HCO3 (5×). Das Harz wurde dann in 6 M Harnstoff in 25 mM NH4HCO3 in Eppendorf-Röhrchen mit niedriger Bindung überführt und mit 5 mM DTT bei 37 °C für 30 Minuten reduziert, gefolgt von einer Alkylierung mit 10 mM Iodacetamid bei 50 °C für 1 Stunde. Die Proben wurden mit PBS (9×) und 25 mM NH4HCO3 (5×) gewaschen. Das Harz wurde dann in neue Eppendorf-Röhrchen mit niedriger Bindung überführt, in 200 μl 25 mM NH4HCO3 resuspendiert und 0,4 μl 0,25 μg μl-1 Trypsin (Promega, Proteomics-Qualität) in 25 mM HEPES hinzugefügt. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C unter Rotation inkubiert. Die Überstände wurden gesammelt, gefolgt von einer zusätzlichen Harzwäsche mit 150 μl 25 mM NH4HCO3, die dem ursprünglichen Überstand zugesetzt wurde. Die Peptide wurden dann vor der weiteren Analyse getrocknet (Speed-Vac).

Mit Ausnahme von S010 wurde die LC-MS/MS-Analyse mit einem Thermo Scientific Easy1200 nLC (Thermo Scientific) durchgeführt, der an ein Tribrid-Orbitrap-Eclipse-Massenspektrometer (Thermo Scientific) gekoppelt war. Die Inline-Entsalzung wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-Trap-Säule (100 μm × 20 mm), gefüllt mit Magic C18AQ (5 μm 200 Å Harz; Michrom Bioresources), durchgeführt, gefolgt von Peptidtrennungen auf einer Umkehrphasen-Säule (75 μm × 270). mm) verpackt mit ReproSil-Pur C18AQ (3 μm 120 Å Harz; Dr. Maisch), direkt montiert auf der Elektrospray-Ionenquelle. Ein 60-minütiger Gradient unter Verwendung eines Systems mit zwei mobilen Phasen bestand aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser (A) und 80 % Acetonitril in 0,1 % Ameisensäure in Wasser (B). Die chromatographische Trennung wurde über einen 60-minütigen Gradienten von 8 bis 30 % B über 57 Minuten, 30 bis 45 % B für 10 Minuten, 45 bis 60 % B für 3 Minuten, 60 bis 95 % B für 2 Minuten erreicht und bei 95 °C gehalten % B für 11 Min. bei einer Flussrate von 300 nl min−1. Eine Sprühspannung von 2.300 V wurde an die Elektrospray-Spitze im Einklang mit einer FAIMS-Quelle angelegt, wobei verschiedene Kompensationsspannungen von –40, –60 und –80 verwendet wurden, während das Orbitrap Eclipse-Instrument im datenabhängigen Modus betrieben wurde und MS-Vermessungsscans durchgeführt wurden Die Orbitrap (normalisierter AGC-Zielwert 300 %, Auflösung 240.000 und maximale Injektionszeit 50 ms) mit einer Zykluszeit von 1 s und MS/MS-Spektrenerfassung wurden in der linearen Ionenfalle (normalisierter AGC-Zielwert 50 % und Injektionszeit) nachgewiesen 35 ms) unter Verwendung einer HCD-Aktivierung mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 27 %. Ausgewählte Ionen wurden nach einer Wiederholungszählung von 1 60 s lang dynamisch ausgeschlossen. Für S010 wurden Peptidproben in 2 % Acetonitril in 0,1 % Ameisensäure (20 μl) gelöst und durch LC/ESI MS/MS mit a analysiert (18 μl). Thermo Scientific Easy-nLC 1000 (Thermo Scientific), gekoppelt an ein Tribrid-Orbitrap-Fusion-Massenspektrometer (Thermo Scientific). Die Inline-Entsalzung wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-Trap-Säule (100 μm × 20 mm), gepackt mit Magic C18AQ (5 μm 200 Å Harz; Michrom Bioresources), durchgeführt, gefolgt von Peptidtrennungen auf einer Umkehrphasen-Säule (75 μm × 250). mm) verpackt mit ReproSil-Pur 120 C18AQ (3 μm 120 Å Harz Dr. Maisch), direkt montiert auf der Elektrospray-Ionenquelle. Für chromatographische Trennungen wurde ein 90-minütiger Gradient von 2 % bis 35 % Acetonitril in 0,1 % Ameisensäure bei einer Flussrate von 300 nl/min verwendet. An die Elektrosprayspitze wurde eine Sprühspannung von 2.200 V angelegt und das Orbitrap Fusion-Instrument im datenabhängigen Modus betrieben, MS-Vermessungsscans erfolgten im Orbitrap (AGC-Zielwert 500.000, Auflösung 120.000 und Injektionszeit 50 ms) mit einer 3 s Zykluszeit und MS/MS-Spektrenerfassung wurden in der linearen Ionenfalle (AGC-Zielwert 10.000 und Injektionszeit 35 ms) unter Verwendung von HCD-Aktivierung mit einer normalisierten Kollisionsenergie von 27 % erfasst. Ausgewählte Ionen wurden nach einer Wiederholungszählung von 1 20 s lang dynamisch ausgeschlossen.

Die Proben wurden mit aktiviertem FragPipe IonQuant63,64,65,66 analysiert. Die Spektren wurden mit einer Datenbank abgeglichen, die menschliche UniProt-Referenzproteine ​​enthielt. UniRef90-Proteine ​​für L. crushatus, L. iners, L. gasseri, L. jensenii, G. vaginalis, A. vaginae, P. bivia und M. mueleris; häufige Verunreinigungen; und umgekehrte Proteinsequenzen als Lockvögel für die Schätzung der falschen Entdeckungsrate (FDR) (abgerufen am 25. Mai 2022). Rohdaten sind in der Zusatzdatei 1 verfügbar. Die Häufigkeitsdaten wurden mit Perseus67 analysiert. Die Häufigkeitsdaten wurden log2-transformiert und mithilfe der Breitenanpassung normalisiert. Für S010 wurden die in zwei von drei Replikaten vorhandenen Proteingruppen gemittelt und die Datentabellen kombiniert. Proteine ​​mit einer mindestens zweifach erhöhten Häufigkeit im Vergleich zur No Probe-Kontrolle in einer biologischen Probe, 2 Spektralzählungen über alle Proben und einer ProteinProphet-Wahrscheinlichkeit > 0,95 (entsprechend ~ 2 % FDR) wurden mit dbCAN 2 nach CAZyme-Domänen durchsucht ( Ref. 68).

CVF-Flüssigkeit (5 μl, nicht zentrifugiert) wurde zu 95 μl 10 mg ml–1 Pullulan (Megazyme) in Reaktionspuffer gegeben. Die Reaktionsmischungen wurden bei 37 °C inkubiert und die Zeitpunkte 3, 5, 8 und 24 Stunden wurden durch 100-fache Verdünnung in 9:1 Acetonitril:Wasser ermittelt. Die Proben wurden weiter 1.000-fach in Acetonitril verdünnt und wie oben beschrieben mittels LC-MS analysiert. Die Proben wurden auf eine Kontrolle ohne Enzym normalisiert.

Die Hemmwirkung einer Gruppe von vier niedermolekularen Inhibitoren wurde mithilfe einer Modifikation des oben verwendeten Amylase-Aktivitätstests in CVLs bestimmt. Für das erste Screening wurden die Enzyme mit 1 mM Acarbose (Abcam), Acarviosin (Toronto Research Products), Voglibose (Spectrum Chemical) oder Miglitol (Tokyo Chemical) 15 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. Für die IC50-Analyse wurde das Enzym (2,5–50 nM) mit Acarbose im Bereich von 0,366 μM bis 3.000 μM in einem Gesamtvolumen von 50 μl vorinkubiert. Die Reaktionen wurden mit 50 μl Substrat gestartet und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, wobei die Fluoreszenz bei 485/528 nm überwacht wurde. Die anfänglichen Raten wurden berechnet, indem die höchste Steigung bestimmt wurde, die mindestens 8 Datenpunkte abdeckte. Die prozentuale Aktivität wurde durch Normalisierung der Aktivität auf eine Kontrolle ohne Inhibitor berechnet. Die IC50-Werte wurden mithilfe einer nichtlinearen Anpassung der Daten an den Inhibitor gegenüber der normalisierten Antwortfunktion (GraphPad Prism 8) berechnet. Der mit den IC50-Werten verbundene Fehler stellt 95 %-Konfidenzintervalle dar.

Für keinen der statistischen Vergleiche wurde eine statistische Methode verwendet, um die Stichprobengröße vorab zu bestimmen. Unsere Stichprobengröße war jedoch ähnlich wie bei früheren Arbeiten zu diesem Thema21. Bei allen statistischen Tests wurde davon ausgegangen, dass die Datenverteilung normal ist, dies wurde jedoch nicht offiziell getestet. Die Randomisierung war für diese Studie nicht relevant, da wir die Teilnehmer nicht in Gruppen einteilten. Ein ROUTE-Test wurde verwendet, um Ausreißer in der Aktivitätsanalyse der CVL-Proben zu identifizieren und zu entfernen (Extended Data Abb. 8). Die Forscher, die die Aktivitätsanalyse der klinischen Proben durchführten, waren im Verlauf der Studie blind für die Metadaten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Proteinidentifikationsnummer in der NCBI-Datenbank für jedes charakterisierte Enzym lautet wie folgt: L. Crispatus PulA (EEU28204.2), L. iners PulA (EFQ51965.1), G. vaginalis PulA (EPI56559.1), M. mulieris PulA (EEZ90738.1), P. bivia PulA (WP_061450340.1), P. bivia GH13 (WP_036862728.1). Das Genom von L. Crispatus C0176A1 (PulA−) ist unter der Zugangsnummer JAEDCG000000000 zu finden. Die in dieser Studie verwendeten metagenomischen und metatranskriptomischen Datensätze finden Sie unter Bioproject PRJNA797778. Auf die Proteomikdaten dieser Studie kann in der PRIDE-Datenbank unter dem Zugangscode PXD042917 zugegriffen werden. Anmerkungen zu Proteindomänen stammten aus den Pfam- und CAZy-Datenbanken. Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in einem Datenrepository auf synapse.org verfügbar und können unter https://www.synapse.org/#!Synapse:syn51422003 abgerufen werden. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken A. Woo für die Hilfe beim Klonen mehrerer bakterieller PulA-Homologe, B. Fu für die kritische Lektüre des Manuskripts und A. Bergerat-Thompson vom Massachusetts General Hospital für die Bereitstellung von CVL-Proben; H. Overkleeft (Universität Leiden) und G. Davies (Universität York) für die großzügige Schenkung der ABPP-Sonden; allen Mitgliedern des Vaginal Microbiome Research Consortium der Bill and Melinda Gates Foundation für die hilfreichen Gespräche über die Arbeit; die Studienteilnehmer für die Spende der CVL- und CVF-Proben; und D. Relman (Stanford University) für die Schenkung des L. Crispatus C0176A1. Finanzielle Unterstützung für diese Studie wurde von der Bill and Melinda Gates Foundation bereitgestellt (Vergabenummer OPP1189211 an EPB). Zusätzliche Unterstützung wurde von der Proteomics and Metabolomics Shared Resource des Fred Hutch/University of Washington Cancer Consortium (Vergabenummer P30 CA05704 an CW) bereitgestellt. EPB ist ein Forscher des Howard Hughes Medical Institute. MIH-P. wurde als Fellow im Pediatric Scientist Development Program (Preis-Nr. HD000850) vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development und durch ein Physician Scientist Fellowship der Doris Duke Charitable Foundation (Grant-Nr. 2019129) unterstützt. SR-N. wurde durch einen Career Award for Medical Scientists des Burroughs Wellcome Fund, ein Pew Biomedical Scholarship, einen Basil O'Connor Starter Scholar Award des March of Dimes (1K08AI130392-01) und durch das NIGMS/NIH (Auszeichnung DP2GM136652) unterstützt. CW, AKN und MQP wurden vom MJ Murdock Charitable Trust (Auszeichnung NS-201913756) und dem Seattle University College of Science and Engineering unterstützt. PP wurde durch das National Science Foundation Graduate Research Fellowship (NSF-GRFP) unterstützt. MTF und JR wurden von der Bill and Melinda Gates Foundation unterstützt (Preis Nr. OPP1189217).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dominick J. Jenkins, Benjamin M. Woolston.

Abteilung für Chemie und Chemische Biologie, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Dominick J. Jenkins, Benjamin M. Woolston, Paula Pelayo und Emily P. Balskus

Fakultät für Chemieingenieurwesen, Northeastern University, Boston, MA, USA

Benjamin M. Woolston

Abteilung für Infektionskrankheiten und Abteilung für Gastroenterologie, Abteilung für Pädiatrie, Boston Children's Hospital, Boston, MA, USA

M. Indriati Hood-Pishchany & Seth Rakoff-Nahoum

Abteilung für Mikrobiologie, Harvard Medical School, Boston, MA, USA

M. Indriati Hood-Pishchany & Seth Rakoff-Nahoum

Fakultät für Chemie, Seattle University, Seattle, WA, USA

Alyssa N. Konopaski, M. Quinn Peters und Christopher Whidbey

Institut für Genomwissenschaften, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Michael T. France & Jacques Ravel

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, University of Maryland School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Michael T. France & Jacques Ravel

Vincent Center for Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, USA

Caroline M. Mitchell

Harvard Medical School, Boston, MA, USA

Caroline M. Mitchell

Howard Hughes Medical Institute, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Emily P. Balskus

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EPB, BMW, SR-N. und MIH-P. konzipierte die Studie. DJJ und BMW konzipierten und führten Experimente zur Enzymreinigung und biochemischen Charakterisierung durch. EPB, DJJ, BMW, CW, SR-N. und MIH-P. hat das Manuskript geschrieben. DJJ und MIH konzipierten und führten Experimente zum Bakterienwachstum durch. CW, ANK und MQP haben ABPP-Experimente entworfen und durchgeführt. DJJ, PP und EPB entwickelten eine bioinformatische Analyse metagenomischer und metatranskriptomischer Daten. PP führte eine bioinformatische Analyse von Multi-Omics-Sequenzierungsdaten durch. MTF und JR unterstützten beim Zugriff, der Analyse und der Interpretation der metagenomischen und metatranskriptomischen Daten. CMM stellte CVL-Beispiele und entsprechende Metadaten bereit. Alle Autoren trugen zur Interpretation der Daten bei, waren an der Überarbeitung des Manuskripts beteiligt und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Seth Rakoff-Nahoum, Christopher Whidbey oder Emily P. Balskus.

CMM war als Berater für Scynexis Inc und Ferring Pharmaceuticals tätig und erhielt Forschungsgelder von Scynexis, Inc. JR ist Mitbegründer von LUCA Biologics, einem Biotechnologieunternehmen, das sich auf die Umsetzung der Mikrobiomforschung in lebende Biotherapeutika für die Gesundheit von Frauen konzentriert. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Microbiology dankt Nicole Koropatkin und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

2 μg gereinigtes Protein wurden auf ein Biorad (2–14 % Bis-Tris) SDS-Seitengel geladen. Von links nach rechts: Precision Plus Protein All Blue Standards (BioRad); L. Crispatus PulA, 137 kD; L. iners PulA, 192 kD; M. mulieris PulA, 151 kD; G. vaginalis PulA, 219 kD; P. bivia GH 13, 70,4 kD; P. bivia PulA, 72,8 kD; Precision Plus Protein All Blue Standards (BioRad). Molekulargewichte heterolog exprimierter Proteine ​​wurden in EXPASY vorhergesagt. Dieses Experiment wurde zweimal wiederholt und zeigte ähnliche Ergebnisse (n = 2).

Quelldaten

A. Wachstum von L. Crispatus C0176A1 (pulA–), das alle relevanten Kontrollen für Proteinkomplementierungstests enthält. b. Wachstum von L. Crispatus MV-1A-US (pulA+) mit allen relevanten Kontrollen für Proteinkomplementierungstests. Die Glykogen-, Maltose- und Glukosebedingungen werden aus denselben Daten in allen Diagrammen in jedem Panel abgeleitet. Alle Wachstumsdaten bestehen aus drei unabhängigen Experimenten, die über drei Tage durchgeführt wurden (n = 3).

Quelldaten

A. Kinetische Michaelis-Menten-Analyse für Tests mit Glykogen. B. Kinetische Michaelis-Menten-Analyse für Tests mit Pullulan c. Kinetische Michaelis-Menten-Analyse für Tests mit Amylose. Alle Daten sind repräsentativ für drei Versuchswiederholungen, die über zwei Tage durchgeführt wurden. Die nichtlineare Anpassung wurde in Graphpad Prism 8 durchgeführt.

Quelldaten

A. 2 μg Mutanten des aktiven Zentrums und Wildtyp G. vaginalis PulA wurden auf ein SDS-Seitengel von Biorad (2–14 % Bis-Tris) geladen. Dieses Experiment wurde zweimal wiederholt und zeigte ähnliche Ergebnisse (n = 2). B. Spezifische Aktivität von Mutanten des aktiven Zentrums auf Glykogen. Das eingefügte Diagramm zeigt spezifische Aktivitätsdaten für G. vaginalis-Mutanten. ∆AS1, ∆AS2 und ∆DBL repräsentieren D233A, D1317A bzw. beide Mutationen. Die Daten sind repräsentativ für drei experimentelle Wiederholungen über zwei Tage. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert dar.

Quelldaten

1 μl jedes Standards (10 mg/ml) und der enzymatischen Reaktionsmischung wurden auf eine TLC-Platte (20 cm x 20 cm, Analtech Silicagel HLF) getüpfelt. Die DC wurde etwa 5 Stunden lang in Butanol:Essigsäure:Wasser 3:2:1 durchgeführt und mit Schwefelsäure:Ethanol 1:19 gefärbt. Diese Ergebnisse sind repräsentativ für zwei Studien, die ähnliche Ergebnisse zeigten (n = 2).

A. Auswirkungen bekannter Amylase-Inhibitoren (1 mM) auf die Aktivitäten gereinigter GDEs gegenüber einem BODIPY-fluoreszierenden Stärkesubstrat (n = 1). B. Hemmwirkung von Acarbose gegenüber gereinigten extrazellulären Amylasen. Es wurde ein BODIPY-Substrat aus fluoreszierender Stärke verwendet und die Aktivität auf eine Kontrolle ohne Inhibitor normalisiert. Die Daten sind repräsentativ für drei experimentelle Wiederholungen über zwei Tage. C. Bakterien wurden in Gegenwart der angegebenen Acarbose-Konzentrationen in Medien gezüchtet, die entweder Glucose, Maltose oder Glykogen als primäre Kohlenhydratquelle enthielten. Das Wachstum in Gegenwart des Inhibitors normalisierte sich gegenüber der unbehandelten Kontrolle. Die IC50-Werte wurden mithilfe einer Regression der kleinsten Quadrate der normalisierten Werte berechnet. ND (Nicht bestimmt) wird angezeigt, wenn die resultierende Kurvenanpassung schlecht war und ein IC50-Wert nicht sicher bestimmt werden konnte oder die Gesamtwachstumshemmung weniger als 10 % betrug. Die Daten sind repräsentativ für mindestens zwei biologische Replikate, die über zwei Tage durchgeführt wurden.

Quelldaten

% Positive stellt den Prozentsatz der Proben dar, die Reads enthielten, die unseren Abfrageproteinen zugeordnet waren (Reads > 0). Die Stichprobengröße ist wie folgt: CST I, n = 39; CST II, ​​n = 16; CST III, n = 31; CST IV, n = 83; CST V, n = 9.

Quelldaten

Ausreißer wurden mithilfe eines ROUT-Tests ermittelt und entfernt. Zur Bestimmung der Korrelation wurde ein zweiseitiger Pearson-Test verwendet (pH 4,4, r = 0,8556, 95 %-KI 0,6472 bis 0,9450, p < 0,0001; pH 5,5, r = 0,9611, 95 %-KI 0,8966 bis 0,9857, p < 0,0001; pH 6,8). , r = 0,9713, 95 % KI 0,9252 bis 0,9891, p <0,0001) Die Aktivitätsdaten stellen den Mittelwert von drei Experimenten über zwei Tage dar und der ELISA-Nachweis ist der Mittelwert von zwei Experimenten über zwei Tage. Fehlerbalken stellen eine Standardabweichung über und unter dem Mittelwert dar.

Quelldaten

Spektralzählungen geben die Summe der Gesamtspektren an, die einem Protein in allen sechs Einzelproben zugeordnet werden können. Abkürzungen: Li PulA, L. iners PulA; Lc PulA, L. Crispatus PulA; Gv AmyA, G. vaginalis AmyA; GAA, humane lysosomale α-Glucosidase; AMY1, menschliche Speichelamylase; SP, Signalpeptid; SlpA, Oberflächenschichtprotein A; GH, Glycosid-Hydrolase-Domäne; PUD, bakterielle Pullulanase-assoziierte Domäne; CBM, Kohlenhydratbindungsmodul.

Die Zeitpunkte der CVF-Reaktionen wurden entfernt und bei 3, 5, 8 und 24 Stunden eingefroren. Diese Daten stammen aus drei experimentellen Wiederholungen über zwei Tage.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–5 und Tabellen 1–4.

Statistische Quelldaten.

Statistische Quelldaten.

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Unverarbeitetes SDS-PAGE-Gel.

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Unverarbeitetes SDS-PAGE-Gel.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jenkins, DJ, Woolston, BM, Hood-Pishchany, MI et al. Bakterielle Amylasen ermöglichen den Glykogenabbau durch das vaginale Mikrobiom. Nat Microbiol 8, 1641–1652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01447-2

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Eingegangen: 08. Juli 2021

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 10. August 2023

Ausgabedatum: September 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01447-2

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