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Das Amidderivat der Anticopalsäure induziert Non

Dec 13, 2023Dec 13, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13456 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Anticopalsäure (ACP), ein Diterpenoid vom Labdan-Typ, das aus Rhizomen von Kaempferia elegans gewonnen wird, wurde zusammen mit 21 halbsynthetischen Derivaten auf ihre zytotoxische Aktivität gegenüber Krebs untersucht. Die meisten Derivate zeigten in einer Gruppe von neun Krebszelllinien eine höhere zytotoxische Aktivität als die Ausgangsverbindung ACP. Unter den getesteten Verbindungen zeigte das Amid 4p die höchste zytotoxische Aktivität gegenüber den Leukämiezelllinien HL-60 und MOLT-3 mit IC50-Werten von 6,81 ± 1,99 bzw. 3,72 ± 0,26 µM. Interessanter ist, dass das Amidderivat 4l eine zytotoxische Aktivität mit einem IC50 von 13,73 ± 0,04 µM gegen die dreifach negative Brustkrebszelllinie MDA-MB-231 zeigte, die die aggressivste Art von Brustkrebs darstellt. Mechanistische Studien ergaben, dass 4l den Zelltod in MDA-MB-231-Zellen durch nicht-apoptotisch regulierten Zelltod induziert. Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse, dass Verbindung 4l die Phosphorylierung des FAK-Proteins konzentrationsabhängig verringerte. Molekulare Docking-Simulationen zeigten, dass Verbindung 4l möglicherweise die FAK-Aktivierung durch Bindung an eine Tasche der FAK-Kinasedomäne hemmen könnte. Die Daten deuten darauf hin, dass Verbindung 4l ein potenzieller FAK-Inhibitor zur Behandlung von dreifach negativem Brustkrebs sein könnte und einer weiteren Untersuchung wert ist.

Krebs ist die verheerendste Krankheit der Welt und Brustkrebs ist die zweithäufigste Todesursache aller Krebsarten1. Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) wurde im Jahr 2020 bei rund 7,8 Millionen Frauen weltweit Brustkrebs diagnostiziert2. Obwohl selten, kommt Brustkrebs auch bei Männern und Transgender-Personen vor3. Brustkrebs ist eine hochkomplexe Krankheit, die in viele Subtypen eingeteilt wird, von denen jeder seine eigenen biologischen Merkmale, Genexpressionsprofile und klinischen Verhaltensweisen aufweist4. Unter den Brustkrebs-Subtypen ist der dreifach negative Brustkrebs (TNBC) der aggressivste und weist die höchste Rezidivrate, Metastasierungsausbreitung und das höchste Mortalitätsrisiko auf5. TNBC ist durch die fehlende Expression des Östrogenrezeptors (ER), des Progesteronrezeptors (PR) und des humanen epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors 2 (HER2) gekennzeichnet. Dieser Subtyp ist für etwa 15 % aller diagnostizierten Brustkrebserkrankungen und 25 % aller brustkrebsbedingten Todesfälle verantwortlich4. Aufgrund des Mangels an geeigneten zielgerichteten Rezeptoren sind gängige Brustkrebsbehandlungen wie Hormontherapie und gezielte Therapie gegen ER, PR und HER2 bei TNBC-Patienten wirkungslos. Infolgedessen stehen für TNBC nur begrenzte Behandlungsmöglichkeiten zur Verfügung und es ist bekannt, dass es ein schlechteres klinisches Ergebnis als andere Brustkrebs-Subtypen hat. Chemotherapie bleibt eine Standardbehandlung für TNBC, es kommt jedoch häufig zu Chemoresistenzen5. Diese Probleme zeigen, wie wichtig es ist, neue Medikamente oder wirksame Behandlungsmöglichkeiten für TNBC zu finden.

Naturstoffe leisten seit langem einen wichtigen Beitrag zur Arzneimittelentwicklung, insbesondere gegen Krebs und Infektionskrankheiten6,7. Sie dienen als gute Quelle für neue Medikamente, da es sich in der Regel um erschwingliche Materialien handelt, die über verschiedene Gerüste, Pharmakophore und Zugänglichkeit verfügen. Darüber hinaus können Naturstoffe in Kombination mit chemischer Synthese als Ausgangspunkte für den Zugang zu vielfältigen Molekülstrukturen mit verstärkter Bioaktivität und gewünschter Bioverfügbarkeit genutzt werden. Aus diesen Gründen wird in der Literatur regelmäßig über das Konzept der Isolierung eines Naturprodukts für Leitstrukturoptimierungsstudien oder die Erstellung von Screening-Bibliotheken berichtet8. Um diese Strategie wirksam zu machen, sind jedoch (1) der Zugang zu ausreichenden Vorräten für die großtechnische Isolierung des gewünschten Naturprodukts, (2) die hohe Häufigkeit des gewünschten Naturprodukts aus der Naturproduktquelle und (3) die Das Vorhandensein chemischer Funktionalitäten im Naturstoffgerüst ermöglicht die einfache und ertragreiche Erzeugung von Derivaten. Daher gelten Naturprodukte, die diese Kriterien erfüllen könnten, als gute Quellen für ein auf Naturprodukten basierendes Arzneimittelforschungsprogramm.

Anticopalsäure (ACP), bekannt als (+)-Copalsäure (Abb. 1), ist ein bizyklisches Diterpenoid vom Labdan-Typ, das zuvor aus mehreren Pflanzen isoliert wurde, darunter Vitex hemsley9, Eperua purpurea10, Eperua leucantha11, Pinus monticola12,13, Pinus strobus13 und Oxystigma oxyphyllum14,15. Im Jahr 2018 isolierte unsere Gruppe ACP in großen Mengen (~ 23 %) aus dem Rohextrakt der Rhizome von Kaempferia elegans16,17. Da es sich bei Kaempferia elegans um eine Pflanze aus der Familie der Ingwergewächse handelt, die sich leicht kultivieren lässt, gilt ACP aufgrund seines niedrigen Molekulargewichts (304 Da) als besonders attraktives Naturstoffgerüst und verfügt über mehrere stereogene Zentren (n = 3), die ihm eine einzigartige Wirkung verleihen 3D-Form) und enthält einen potenziellen chemischen Angriffspunkt, beispielsweise eine Carbonsäure im Molekül. Daher kann ACP ein guter Kandidat als Ausgangspunkt für die Optimierung neuartiger bioaktiver Wirkstoffe auf Naturstoffbasis sein. Es ist erwähnenswert, dass Anticopalsäure eines der seltenen Naturprodukte ist, die in der Natur beide enantiomeren Formen aufweisen18. (−)-Copalsäure (COPA) (Abb. 1), die entgegengesetzte enantiomere Form von ACP, ist das wichtigste in der Volksmedizin vorkommende Diterpenoid, Copaibaöl19.

(−)-Copalsäure (COPA) und (+)-Copalsäure (Anticopalsäure, ACP).

Aufgrund der umfassenden Anwendung von Copaiba-Öl in der Volksmedizin und seiner jüngsten Beliebtheit in der Kosmetik- und Pharmaindustrie wurden COPA und seine Derivate verschiedenen wissenschaftlichen Studien unterzogen, um ihre biologischen Aktivitäten nachzuweisen. Frühere Studien haben gezeigt, dass COPA interessante Bioaktivitäten besitzt, darunter antibakterielle20,21, antimykotische22, entzündungshemmende23,24, antituberkulose25 und krebszytotoxische26 Eigenschaften. Es wurde auch über Studien zu COPA-Derivaten berichtet, die bessere Bioaktivitäten als die Ausgangssubstanz COPA aufwiesen. Beispielsweise lieferten das hydrierte COPA-Derivat und die COPA-Derivate mit Epoxid-, Diketon- oder Natriumcarboxylat-Einheiten eine viel höhere Anti-Tuberkulose-Aktivität21,25. Einige COPA-Amid-Analoga verbesserten ihre Aktivitäten bei der Herunterregulierung der Expression des Androgenrezeptors zur Behandlung von Prostatakrebs27.

Im Gegensatz zu COPA ist über die Bioaktivitäten von ACP wenig bekannt. Bisher liegen nur Berichte über die antimikrobielle Wirkung von ACP16,28 und die fraßhemmende Wirkung von ACP und Derivaten gegen Spodoptera frugiperda vor9. Angesichts der begrenzten vorhandenen Studien zur Bioaktivität von ACP und der möglichen Verwendung von ACP bei der Entdeckung naturstoffbasierter Arzneimittel haben wir mit der Synthese und zytotoxischen Bewertung von ACP-Derivaten begonnen. Hierin wurde die zytotoxische Aktivität von ACP-Derivaten, hauptsächlich der Amid-Analoga, gegen neun Krebszelllinien und die normale Zelllinie MRC-5 bewertet. Darüber hinaus wurden die molekularen Mechanismen und biologischen Ziele des ACP-Derivats 4l in dreifach negativen MDA-MB-231-Brustkrebszellen aufgeklärt.

Die Bildung der ACP-Derivate 1–3 und 4a–4s wurde wie in Abb. 2 dargestellt durchgeführt. Dazu gehörten die Reduktion zum Alkohol 2, der Aldehyd 3, die Amidierung zu den Amid-Analoga 4a–4r und die weitere Hydrolyse des Amidmethylester 5q zur Säure 4s. Bemerkenswert ist, dass es sich bei den meisten Derivaten um Amidanaloge handelt, da sie sich für die schnelle Durchführung von Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) eignen. Tatsächlich wird die Amidbildung von medizinischen Chemikern am häufigsten verwendet, und Amidbindungen sind in pharmazeutisch aktiven Substanzen weit verbreitet und werden schätzungsweise in 25 % der vermarkteten Medikamente gefunden29.

Synthese von ACP-Derivaten.

Die Ausbeute der synthetisierten Derivate war mäßig bis ausgezeichnet (20–100 %). Von diesen Derivaten wurden erstmals neunzehn Verbindungen der Amidderivate beschrieben. Die Strukturen der synthetisierten Verbindungen wurden durch Analyse von NMR-spektroskopischen Daten und MS bestätigt. Die physikalischen Eigenschaften und spektroskopischen Daten der synthetisierten Verbindungen sind in den Zusatzinformationen aufgeführt.

Die synthetischen Verbindungen wurden mithilfe von Standard-MTT- oder abhängiger Brustkrebs), HepG2 (hepatozelluläres Karzinom), A549 (Lungenadenokarzinom), H69AR (multiresistentes kleinzelliges Lungenkarzinom), HuCCA-1 (Cholangiokarzinom einer thailändischen Patientin), HeLa (Zervixkarzinom) und zwei Leukämiezellen Linien, HL-60 (akute promyelozytische Leukämie) und MOLT-3 (akute lymphoblastische T-Zell-Leukämie). Zur Darstellung normaler Zellen wurde die normale embryonale Lungenfibroblastenzelllinie MRC-5 verwendet. Als Positivkontrollen dienten die Chemotherapeutika Doxorubicin und Etoposid. Die IC50-Werte der getesteten Verbindungen sind in Tabelle 1 angegeben.

Die Ergebnisse zeigten, dass die zytotoxische Aktivität fast aller Verbindungen dieser Reihe höher war als die der Ausgangsverbindung ACP. Mehrere Derivate zeigten eine selektive zytotoxische Aktivität gegenüber den Leukämiezelllinien HL-60 und MOLT-3, wobei Verbindung 4p mit einem IC50 von 6,81 ± 1,99 µM für HL-60 und 3,72 ± 0,26 µM für MOLT-3 die stärkste Aktivität aufwies. Darüber hinaus zeigte eine abgeleitete Verbindung 4l eine bemerkenswerte zytotoxische Aktivität gegen die TNBC-Zelllinie MDA-MB-231 mit einem IC50 von 13,73 ± 0,04 µM.

TNBC ist die aggressivste Art von Brustkrebs beim Menschen und es gibt derzeit keine wirksamen Behandlungen5. Beim Screening zeigte Verbindung 4l unter den getesteten Verbindungen die vielversprechendste Zytotoxizität und den höchsten Selektivitätsindex gegenüber MDA-MB-231-Zellen (Tabelle 1, Ergänzungstabelle S1). Darüber hinaus zeigte diese Verbindung einen überlegenen Selektivitätsindex (SI = 2,9) im Vergleich zum positiven Medikament Doxorubicin (SI = 0,3) (siehe Ergänzungstabelle S1). Angesichts dieses Potenzials wurde Verbindung 4l für die weitere Untersuchung seines zytotoxischen Mechanismus in MDA-MB-231-Zellen ausgewählt, um neue Medikamente für die TNBC-Behandlung zu entwickeln.

Unser zytotoxisches Screening umfasst mehrere Krebszelllinien unterschiedlicher Organherkunft (Brust, Leber, Gallengang, Lunge, Gebärmutterhals und Lymphozyten), während nur eine normale Zelllinie (MRC-5-Lungenfibroblast) als Vertreter normaler Zellen verwendet wurde . Die MRC-5-Zelllinie ist eine bekannte normale Zelllinie, die häufig beim zytotoxischen Screening eingesetzt wird31,32. Diese Zelllinie kann problemlos in Standardmedium ohne Verwendung spezieller Zusätze kultiviert werden. Fibroblasten sind ein häufiger Zelltyp, der im Bindegewebe vieler Organe vorkommt. Die Bewertung des Selektivitätsindex (SI) basierend auf der Zytotoxizität gegenüber der MRC-5-Zelllinie spiegelt den Grad der Nebenwirkung der getesteten Verbindungen gegenüber einem weit verbreiteten Zelltyp im Körper wider, lässt sich jedoch nicht auf die Nebenwirkung in den spezifischen Organen schließen. was eine Einschränkung unserer Studie darstellt.

Die Modalität des Zelltods wurde vom Nomenklaturausschuss für Zelltod auf der Grundlage morphologischer Merkmale, biochemischer Ereignisse während der Einleitung des Zelltods und der beteiligten Signalwege in versehentlichen, nicht regulierten Zelltod (Nekrose) und 12 Arten des regulierten Zelltods eingeteilt33. Der regulierte Zelltod kann in apoptotische Zelltodmodi (Apoptose und Anoikis) und nicht-apoptotische Zelltodmodi eingeteilt werden, die weiter in zwei Gruppen unterteilt werden, basierend auf dem Vorhandensein einer Vakuolenakkumulation wie Autophagie oder dem Fehlen von Vakuolen wie Nekroptose34 . Die Mehrzahl der gemeldeten zytotoxischen Naturstoffe löst durch Apoptose den Tod von Krebszellen aus. Jüngste Erkenntnisse zeigten jedoch, dass mehrere Naturstoffe ihre zytotoxische Aktivität durch die Induktion nicht-apoptotischer Zelltodmodi ausüben, wie z. B. Resveratrol-induzierte Autophagie und Shikonin-induzierte Nekroptose35,36.

Die Art des durch Verbindung 4l induzierten Zelltods wurde unter Verwendung von MDA-MB-231-Zellen durch Beobachtung von Veränderungen in der Zellmorphologie und durchflusszytometrischer Analyse von Annexin V/7-AAD-doppelt gefärbten Zellen untersucht. Die Zellen wurden 24–48 Stunden lang mit 4 l in Konzentrationen von 25–50 µM behandelt, die höher sind als der IC50-Wert in dieser Zelllinie. Mikroskopisch führte die 4-Liter-Behandlung nicht zur sofortigen Bildung von Blasen auf der Zelloberfläche (Abb. 3a). Eine versehentliche Zelltodnekrose wird typischerweise durch die unmittelbare Bildung von Blasen auf der Zelloberfläche nach der Behandlung angezeigt37. Diese morphologische Veränderung wurde jedoch bei den mit 4l behandelten Zellen nicht beobachtet, was darauf hindeutet, dass die 4l-Behandlung keine Nekrose hervorrief. Darüber hinaus wurde in den behandelten Zellen erst 48 Stunden nach der Behandlung eine Vakuolenakkumulation beobachtet (Abb. 3a). Zusammenfassend stellten wir die Hypothese auf, dass der 4l-induzierte Zelltod in MDA-MB-231-Zellen nicht durch Nekrose oder vakuolenpräsentierenden regulierten Zelltod wie Autophagie verarbeitet wurde.

Art des Zelltods in MDA-MB-231-Brustkrebszellen, die mit Verbindung 4l behandelt wurden. Die Zellen wurden 24–48 Stunden lang mit 4 l Doxorubicin (DOX) und Shikonin (SKN) in den angegebenen Konzentrationen behandelt. Dann wurden Fotos gemacht und die Zellen einer Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung unterzogen und mit der durchflusszytometrischen Technik analysiert. (a) Morphologie von 4l-behandelten Zellen, ursprüngliche Vergrößerung von × 400. (b,d) Repräsentative Punktdiagramme der durchflusszytometrischen Analyse der behandelten Zellen, die den Prozentsatz lebender Zellen (unten links) und früher apoptotischer Zellen (unten rechts) zeigen. , spät apoptotische Zellen (oben rechts) und tote Zellen (oben links). (c,e) Balkendiagramme, die den Prozentsatz früher apoptotischer Zellen, später apoptotischer Zellen und toter Zellen in einer gesamten Zellpopulation anzeigen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Signifikante Unterschiede zwischen Behandlung und Kontrolle zu entsprechenden Zeitpunkten werden durch *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 angezeigt, und signifikante Unterschiede zwischen 24 Stunden und 48 Stunden werden durch &p < 0,05, &&p < angezeigt 0,01 und &&&p < 0,001.

Interessanterweise zeigte die durchflusszytometrische Analyse mit Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung, dass die 4-l-Behandlung die spätapoptotische Zellpopulation in MDA-MB-231-Zellen dosis- und zeitabhängig deutlich erhöhte. Im Vergleich dazu änderte sich der Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellpopulation im Laufe der Zeit nicht signifikant (Abb. 3b, c). Nach 48 Stunden stieg die spätapoptotische Zellpopulation signifikant von 5,8 % für die Kontrollgruppe auf 19,0–26,3 % für 4l bei 25–50 µM (Abb. 3c). Im Gegensatz dazu lagen die frühen apoptotischen Zellpopulationen bei 4l-Behandlungen zwischen 5,3 und 5,9 %, was sich statistisch nicht von den 4,2 % in der Kontrollgruppe unterschied (Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass der Prozess des 4l-induzierten Zelltods dies nicht tat Fortschritt durch Apoptose im Frühstadium.

Um Annexin V/7-AAD-Doppelfärbungsprofile von apoptotischen und nicht-apoptotischen Zelltodmodi zu vergleichen, wurden Doxorubicin (DOX) und Shikonin (SKN) als Induktoren von Apoptose bzw. Nekroptose eingesetzt. Wie in Abb. 3d, e gezeigt, war beim DOX-induzierten Zelltod die frühe apoptotische Zellpopulation nach 24 Stunden größer als die späte apoptotische Zellpopulation. Dann nahm sie nach 48 Stunden ab, was mit einem zeitabhängigen Anstieg der späten apoptotischen Zellpopulation einherging (Abb. 3e). SKN hingegen zeigte einen zeitabhängigen Anstieg der späten apoptotischen Zellpopulation während der 24–48-stündigen Behandlung, wohingegen die frühe apoptotische Zellpopulation im gesamten Zeitverlauf nicht erhöht war (Abb. 3e). Das Annexin V/7-AAD-Doppelfärbungsprofil von 4l-behandelten Zellen unterscheidet sich von dem des Apoptose-Induktors und ähnelt dem des Nekroptose-Induktors.

Zusammengenommen deuten die Ergebnisse darauf hin, dass der 4l-induzierte Zelltod in MDA-MB-231-Zellen durch einen nicht-apoptotisch regulierten Zelltod vermittelt wurde, was durch einen zeitabhängigen Anstieg der späten apoptotischen Population ohne Anstieg der frühen apoptotischen Population angezeigt wird. Darüber hinaus zeigte die Morphologie der mit 4l behandelten Zellen keine Ansammlung autophagischer Vakuolen, was die Möglichkeit eines autophagischen Zelltods ausschließt. Nekroptose, Ferroptose, Mitoptose, Parthanatos, NETose und Pyroptose sind nicht-apoptotische Zelltodmodi, die nicht zu einer Vakuolenakkumulation führen32. Die genaue Art des durch Verbindung 4l ausgelösten Zelltods wird jedoch mithilfe mehrerer biochemischer Analysen weiter untersucht.

Die meisten derzeit verwendeten Chemotherapeutika beseitigen Tumore, indem sie in Krebszellen Apoptose auslösen. Allerdings ist die Apoptosetoleranz, die durch eine Fehlregulation der apoptotischen Maschinerie verursacht wird, ein Mechanismus, der zur Entwicklung einer Krebs-Multiresistenz beiträgt, die eine der Hauptursachen für das Scheitern chemotherapeutischer Behandlungen darstellt38. Die Induktion des nicht-apoptotischen Zelltodmodus durch kleine Moleküle ist eine attraktive Strategie zur Überwindung des Problems der Apoptose-Umgehung39. Daher ist die Fähigkeit der Verbindung 4l, den nicht-apoptotischen Zelltod auszulösen, von Interesse, was darauf hindeutet, dass die Verbindung vielversprechend für die zukünftige Entwicklung von Krebsmedikamenten ist.

Wir untersuchten ferner Ziele der Verbindung 4l auf Signalwegen für das Zellüberleben, einschließlich EGFR, FAK, Akt und ERK in MDA-MB-231-Zellen. Nach 24-stündiger Behandlung mit 4 l in Konzentrationen von 25–50 µM wurde die Aktivierung (Phosphorylierung) der Signalwege mithilfe der Western-Blot-Analyse bestimmt. Wie in Abb. 4 gezeigt, wurde die Phosphorylierung des FAK-Proteins dosisabhängig selektiv um 4 l reduziert, während die Phosphorylierung von EGFR, Akt und ERK durch die Behandlung nicht beeinträchtigt wurde, was darauf hindeutet, dass die FAK-Hemmung der zytotoxische Mechanismus der Verbindung sein könnte 4l.

Hemmende Wirkung von Verbindung 4l auf Signalwege für das Zellüberleben in MDA-MB-231-Zellen. Nach 24-stündiger Behandlung mit Verbindung 4l wurden die Phosphorylierungsgrade ausgewählter Signalproteine ​​in den behandelten Zellen durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen. Die Ergebnisse sind repräsentative Blots von drei unabhängigen Experimenten.

Um festzustellen, ob die FAK-Hemmung ein Mechanismus ist, der an der Induktion des nicht-apoptotischen Zelltods durch Verbindung 4l in MDA-MB-231-Zellen beteiligt ist, wurden die Zellen mit FAK-spezifischem Inhibitor (1,2,4,5-Benzoltetraamin oder FAKi) behandelt. bei einer zytotoxischen Konzentration (16 μM), gefolgt von einer Analyse der Art des Zelltods. Wie in Abb. 5a gezeigt, war die FAK-Phosphorylierung nach 24-stündiger Behandlung in FAKi-behandelten Zellen deutlich gehemmt. Während des 48-stündigen Behandlungszeitraums wurde in FAKi-behandelten Zellen ein zeitabhängiger Anstieg der späten apoptotischen Zellpopulation beobachtet, der immer größer war als der frühe apoptotische Zellpopulation (Abb. 5b, c). Die Ergebnisse zeigten, dass die FAK-Hemmung in MDA-MB-231-Zellen einen nicht-apoptotischen Zelltod verursachte, ähnlich dem, der in 4l-behandelten Zellen beobachtet wurde.

Art des Zelltods in MDA-MB-231-Zellen, die FAK-spezifischem Inhibitor (FAKi) ausgesetzt waren. Die Zellen wurden 24–48 Stunden lang mit FAKi (16 μM) behandelt. (a) Western-Blot-Analyse der FAK-Phosphorylierung 24 Stunden nach der Behandlung. (b) Repräsentative Punktdiagramme der durchflusszytometrischen Analyse der behandelten Zellen. (c) Balkendiagramme, die den Prozentsatz der frühen apoptotischen Zellen, der späten apoptotischen Zellen und der toten Zellen in der gesamten Zellpopulation anzeigen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt. Signifikante Unterschiede zwischen Behandlung und Kontrolle zum entsprechenden Zeitpunkt werden durch *p < 0,05, **p < 0,01 und ***p < 0,001 angezeigt, und signifikante Unterschiede zwischen 24 und 48 Stunden werden durch &&p < 0,01 angezeigt.

Mehrere Hinweise deuten darauf hin, dass FAK das Zellüberleben sowie mehrere bösartige Eigenschaften von Krebszellen reguliert und in einer Vielzahl von Tumoren häufig überexprimiert wird40. Es wurde berichtet, dass die FAK-Signalübertragung an der Radio-/Chemoresistenz von Krebserkrankungen beteiligt ist. Eine Herunterregulierung von FAK erhöht die zytotoxische Wirkung der Strahlung in Dickdarmkrebszellen41 und erhöht auch die Cisplatin-Empfindlichkeit in TNBC-Zellen42. Die In-vivo-Untersuchung des niedermolekularen FAK-Inhibitors BI 856520 in Mausmodellen für Brustkrebs liefert vielversprechende Ergebnisse zur Unterdrückung des Primärtumorwachstums und des Auswachsens metastatischer Tumoren durch Beeinträchtigung der Zellproliferation sowohl in vitro als auch in vivo43. Mehrere FAK-Inhibitoren werden derzeit in klinischen Studien bei verschiedenen Krebsarten getestet, entweder als Einzeltherapie oder in Kombination mit anderen Krebsmedikamenten44. Daher könnte die Verbindung 4l eine potenzielle Verbindung für die Entwicklung als Chemotherapeutikum zur Behandlung von TNBC sein.

Um die Bindung zwischen FAK und Verbindung 4l zu untersuchen, wurde das molekulare Andocken mit der Software iGEMDOCK v2.1 durchgeführt. Als Rezeptor wurden zwei mögliche Bindungsstellen für niedermolekulare Inhibitoren auf dem FAK-Protein verwendet, die FERM-Domäne und die Kinasedomäne. Im Gegensatz zu FAKi, von dem gezeigt wurde, dass es an einer für Tyr39745 geschlossenen Tasche an die FERM-Domäne bindet, scheint die Bindungsstelle von 4l auf der FERM-Domäne weit von der Tyr397-Tasche entfernt zu sein (Abb. 6a). Andererseits befand sich die Bindungsstelle von 4l auf der Kinasedomäne in einer ATP-Bindungstasche (Abb. 6b), die mit der Bindungsstelle eines anderen FAK-spezifischen Inhibitors, TAE22646, identisch war, was darauf hinweist, dass die katalytische Aktivität von FAK gehemmt würde bei Bindung von 4l. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Verbindung 4l die Tyr397-Autophosphorylierung von FAK reduziert, indem sie die FAK-Kinaseaktivität über die Bindung an die Kinasedomäne und nicht an die FERM-Domäne stört.

Die Bindungspositionen von 4l auf dem FAK-Protein. (a) FAK FERM-Domäne (PDB:2AL6), die Phosphorylierungsstelle Tyr397 sind angegeben, drei Subdomänen sind mit den Farben Violett (F1), Grün (F2) und Rot (F3) gekennzeichnet und Verbindung 4l ist in rosafarbenem Strich dargestellt. (b) FAK-Kinase-Domäne (PDB-ID: 2JKK) mit Verbindung 4l (rosa Stift) und TAE226 (gelber Stift) in der ATP-Bindungstasche (grau).

Wie in Abb. 7a dargestellt, befand sich Redock-TAE226 an derselben Position wie co-kristallisiertes TAE226, was darauf hinweist, dass unsere Docking-Methode akzeptabel war. Die Bindungsenergie von TAE226 betrug – 134,05 kcal/mol und TAE226 bildete zwei Wasserstoffbrücken mit Asp564 und Cys502 (Abb. 7b). Darüber hinaus hatte 4l, wie in Tabelle 2 gezeigt, eine Bindungsenergie von −80,44 kcal/mol. Abbildung 7c zeigt, dass 4l eine Wasserstoffbrücke mit Cys502 der FAK-Kinasedomäne bildete. Fusionierte Cyclohexanringe, Methylkohlenstoff und Methylenkohlenstoff von 4l stellten ebenfalls hydrophobe Kontakte mit Ile428 und Leu501 her (Abb. 7d). Es ist auch zu erkennen, dass es hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Tetrahydropyranring von 4l und vier Aminosäureseitenketten gab, darunter Ala452, Val484, Met499 und Leu553 (Abb. 7d). Dies weist darauf hin, dass kondensierte Cyclohexanringe und der Tetrahydropyranring von 4l als Schlüsseleinheiten bei der Bindung an die katalytische Stelle von FAK fungieren können, was 4l zu einem potenziellen FAK-Inhibitor macht.

Überlagerung von erneut angedocktem TAE226 (rot) und kokristallisiertem TAE226 (gelb) (a), Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkung von TAE226 (b), Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkung von 4l (rosa) (c) und 2D-Diagramm, das die Wechselwirkungen von 4l (d) darstellt die ATP-Bindungstasche der FAK-Kinase-Domäne (PDB-ID: 2JKK).

Um die Arzneimittelfähigkeit47,48 der Verbindung 4l zu bewerten, wurde der SwissADME-Websitedienst genutzt, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften zu untersuchen und nach den Regeln von Lipinski und Veber zu analysieren. Zum Vergleich mit 4l wurde auch die Berechnung der Ausgangsverbindung ACP durchgeführt. Die berechneten Parameter sind in Tabelle 3 dargestellt. Unter Berücksichtigung der Fünferregel von Lipinski entsprechen die Parameter dieser beiden Verbindungen, einschließlich des Molekulargewichts, der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsakzeptoren und der Anzahl der Wasserstoffbrückenbindungsdonatoren, der Regel. Allerdings liegen die MLogP-Werte, die die Lipophilie der Verbindung darstellen, etwas über der angegebenen Anforderung (4.15)49. Diese MLogP-Werte stimmen mit den LogS-Werten überein, die auf die geringere Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen hinweisen. Dennoch weisen Verbindung 4l und ACP einen hohen Anteil an sp3 (Fsp3) auf, was auf einen hohen Grad an Sättigung und Chiralität hinweist, was eine signifikante Präferenz für die Bindung und Selektivität an Proteine ​​fördern könnte. Schließlich haben Verbindung 4l und ACP TPSA-Werte deutlich unter 140 Å2, was auf eine gute Zellmembranpermeabilität hinweist, da Moleküle mit einem TPSA-Wert über 140 (Å2) dazu neigen, Zellmembranen schlecht zu durchdringen50. Darüber hinaus führt die Einführung der Amidsubstituenten zu einer Erhöhung des TPSA von 4l, wodurch der TSPA-Wert von 4l nahe an den Bereich herankommt, der dem erfolgreichsten Arzneimittel zugeschrieben wird (≤ 60–70 Å2). Den physiochemischen Parametern zufolge wiesen sowohl 4l als auch ACP Parameter auf, die für eine entsprechende Arzneimittelfähigkeit geeignet waren, mit Ausnahme der Löslichkeit der Verbindungen. Die chemische Modifikation der Ausgangsverbindungen bei der Arzneimittelentwicklung zielt im Allgemeinen darauf ab, entweder die physiochemischen Eigenschaften oder die Wirksamkeit der Arzneimittel oder beides zu verbessern. Obwohl Verbindung 4l in dieser Studie keine Verbesserung hinsichtlich der physiochemischen Parameter im Vergleich zur Ausgangsverbindung ACP zeigte, zeigte Verbindung 4l eine viel höhere Wirksamkeit als ACP, was auf eine Verbesserung der Wirksamkeit der Arzneimittel durch die Modifikation hinweist. Eine weitere Derivatisierung der Verbindungen könnte bessere physiochemische Werte ermöglichen, die der Arzneimittelähnlichkeitsrichtlinie entsprechen.

1H- und 13C-NMR-Spektren wurden in CDCl3 oder DMSO-d6 mit einem Bruker AVANCE 300 NMR- oder einem Bruker AVANCE 400 NMR-Spektrometer aufgenommen. 1H-NMR- und 13C-NMR-chemische Verschiebungen (δ) Chemische Verschiebungen wurden in ppm ausgedrückt und auf die Signale des Restlösungsmittels bezogen. Kopplungskonstanten (J) wurden in Hertz (Hz) angegeben. IR-Spektren wurden mit einem PerkinElmer Spectrum One-Spektrometer unter Verwendung einer ATR-Technik (Universal Attenuated Reflectance) aufgezeichnet und in cm-1 angegeben. Die HRESIMS-Analyse wurde mit einem Bruker Daltonics microTOF-Spektrometer durchgeführt. Optische Drehungen wurden mit einem Polarimeter JASCO P-1020 gemessen. Alle Glaswaren wurden vor der Verwendung hitzegetrocknet. TLC wurden unter Verwendung von UV-Licht (254 und 366 nm) und Godin-Reagenz sichtbar gemacht.

Die in dieser Studie verwendeten Rhizome des Wildtyps K. elegans stammten aus dem ländlichen Gebiet im Distrikt Sai Yok, Provinz Kanchanaburi, Thailand und wurden von den Einheimischen, die in der Gegend leben, mit deren Erlaubnis gesammelt. Die Pflanze wurde von einem Taxonomen, Professor Dr. Wongsatit Chuakul von der Fakultät für Pharmazie der Mahidol-Universität, Thailand, authentifiziert. Das Gutscheinexemplar mit der Nummer BKF 192.348 (Thongnest Nr. 2) wurde beim Department of National Parks, Wildlife and Plant Conservation, Ministry of Natural Resources and Environment, Bangkok, Thailand, hinterlegt. Alle Verfahren zur Pflanzensammlung wurden in Übereinstimmung mit den einschlägigen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen durchgeführt.

Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Lösungsmittel aus handelsüblichen Lösungsmitteln destilliert. Dichlormethan (CH2Cl2) wurde für den Reaktionsaufbau durch Druckfiltration durch aktiviertes Aluminiumoxid weiter gereinigt. Für spektroskopische Messungen wurden Lösungsmittel mit Spektralqualität verwendet. Die Dünnschichtchromatographie wurde auf vorbeschichteten Silicagel 60 F254-Platten von Merck durchgeführt. Für die Flash-Säulenchromatographie wurde Kieselgel 60 (Silicycle, 230–400 Mesh) und für die präparative Dünnschichtchromatographie Kieselgel 60 PF254 (Merck) verwendet. Zur TLC-Detektion wurden mit Kieselgel vorbeschichtete Aluminiumplatten (F254, 0,25 mm) verwendet. Das Muse® Annexin V & Dead Cell Kit wurde von Luminex (Austin, TX, USA) gekauft. Doxorubicin, Etoposid und Shikonin wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen. Der FAK-spezifische Inhibitor (1,2,4,5-Benzoltetraamintetrahydrochlorid oder FAK-Inhibitor 14) wurde von Tocris Bioscience (Bristol, UK) bezogen. Der Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und alle Antikörper wurden von Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) bezogen. SuperSignal™ ECL-Substrate wurden von Thermo Scientific (Rockford, IL, USA) gekauft.

MDA-MB-231 (dreifach negativer Brustkrebs), T-47D (hormonabhängiger Brustkrebs), HepG2 (hepatozelluläres Karzinom), HL-60 (akute promyelozytische Leukämie), MOLT-3 (akute lymphoblastische T-Zell-Leukämie) , A549 (Lungenadenokarzinom), H69AR (multiresistentes kleinzelliges Lungenkarzinom), HeLa (Zervixkarzinom) und MRC-5 (normaler embryonaler Lungenfibroblast) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) erhalten ). HuCCA-1 (Cholangiokarzinom eines thailändischen Patienten) wurde vom Laboratory of Immunology, Chulabhorn Research Institute, Thailand, erhalten.

Die Rhizome von K. elegans (25 kg) wurden mit Dichlormethan (2 × 70 l) bei Raumtemperatur extrahiert. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels wurde ein Rohextrakt (420,6 g) erhalten. Der rohe Dichlormethanextrakt (420,6 g) wurde über eine Kieselgelsäule unter Verwendung eines Stufengradientensystems mit Hexan-CH2Cl2 (100:0 bis 0:100) und CH2Cl2-MeOH (100:0 bis 0:100) chromatographiert, um achtzehn Fraktionen zu ergeben (F1-F18) nach TLC-Detektion. Eine der ACP-reichen Fraktionen (Fraktion F7, 38,5 g) wurde durch Silica-Säulenchromatographie gereinigt und mit n-Hexan-CH2Cl2 (95:5 bis 0:100) und CH2Cl2-MeOH (100:0 bis 90:10) eluiert reines ACP als weißes amorphes (34,5 g). Die Struktur des aus dem Pflanzenextrakt gewonnenen ACP wurde anhand von 1H- und 13C-NMR-Spektraldaten im Vergleich zu den vorherigen Daten16 identifiziert. Mehrere andere ACP-reiche Fraktionen werden zu gegebener Zeit für die zukünftige Isolierung verwendet.

Zu einer Lösung von ACP (25 mg, 0,08 mmol, 1,0 Äquiv.) in CH2Cl2 (0,8 ml, 0,1 M) wurden HOBt (16,5 mg, 0,12 mmol, 1,5 Äquiv.) und EDCl (23,4 mg, 0,12 mmol, 1,5 Äquiv.) gegeben. ). Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in THF (0,8 ml, 0,1 M) gelöst, auf 0 °C abgekühlt und der Mischung NaBH4 (9,2 mg, 0,24 mmol, 3,0 Äquiv.) zugesetzt. Dann wurde H2O (2 µL, 0,12 mmol, 1,5 Äquiv.) zu einer Lösung gegeben. Die resultierende Mischung wurde 30 Minuten lang bei 0 °C gerührt und dann mit MeOH (1 ml) gequencht. Die Mischung wurde unter Vakuum getrocknet und erneut in EtOAc gelöst. Die organische Schicht wurde mit 10 %iger Zitronensäure und Kochsalzlösung gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und unter Vakuum konzentriert. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie unter Elution mit EtOAc:Hexan (10:90) gereinigt, um 6 mg (25 %) Anticopalol (2)16 als farbloses Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{\mathrm{D}}^{27}\) = + 30,3 (c 0,95, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3356, 2923, 2847, 1662, 1642, 1457, 1442, 1387, 996, 887 cm‒1; 1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δH 4,83 (1H, d, J = 1,3 Hz, H-17), 4,51 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-17), 4,18 (1H, dd, J = 6,9). , 1,2 Hz, H-14), 4,18 (1H, d, J = 6,9 Hz, H-15), 2,40 (1H, ddd, J = 12,8, 4,2, 2,5 Hz, H-7), 2,16 (2H, ddd , J = 14,0, 9,8, 4,0 Hz, H2-12), 1,98 (1H, td, J = 12,9, 5,0 Hz, H-7), 1,76 (1H, m, H-1), 1,71 (1H, m, H-6), 1,67 (3H, s, H3-16), 1,61 (1H, m, H-11), 1,57 (1H, m, H-9), 1,56 (1H, m, H-2), 1,49 (1H, m, H-2), 1,43 (1H, m, H-11), 1,39 (1H, m, H-3), 1,32 (1H, tdd, J = 12,9, 12,9, 4,3 Hz, H-6 ), 1,18 (1H, td, J = 12,8, 4,9 Hz, H-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,5, 2,7 Hz, H-5), 0,90 (3H, s, H3-19), 0,80 (3H, s, H3-18), 0,67 (3H, s, H3-20); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δ 148,6 (C-8, s), 140,6 (C-13, s), 123,1 (C-14, d), 106,2 (C-17, t), 59,4 (C-15 , t), 56,4 (C-9, d), 55,6 (C-5, d), 42,2 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,5 (C-12, t), 38,4 (C-7, t), 33,7 (C-19, q), 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,9 (C-11, t), 21,7 (C-19, q), 19,4 (C-2, t), 19,3 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C20H34NaO, m/z 313,2502 [M + Na]+, gefunden 340,2502.

Anticopalol (2) (5,5 mg, 0,018 mmol, 1,0 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (0,18 ml, 0,1 M) gelöst. Dann wurde Dess-Martin-Periodinan (9,6 mg, 0,022 mmol, 1,2 Äquiv.) langsam zu einer Mischung gegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit NH4Cl (wässrig) aufgearbeitet. Die Mischung wurde mit EtOAc und Kochsalzlösung extrahiert und über Na2SO4 getrocknet. Der Rohextrakt wurde unter Vakuum konzentriert und durch Säulenchromatographie unter Elution mit EtOAc:Hexan (20:80) gereinigt, um 6,6 mg (100 %) des Aldehyds 3 als Substanz zu ergeben gelbes Öl. \({[\mathrm{\alpha }]}_{\mathrm{D}}^{27}\) = + 10,5 3 (c 0,48, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 2925, 2865, 1694, 1642, 1459, 1441, 1387, 1260, 1094, 1018, 887, 802 cm‒1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH 9,99 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-15), 5,87 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-14), 4,84 (1H, brs, H-17 ), 4,46 (1H, brs, H-17), 2,39 (1H, m, H-7), 2,32 (1H, m, H-12), 2,15 (3H, s, H3-16), 2,04 (1H, m, H-12), 1,94 (1H, m, H-7), 1,74 (1H, m, H-11), 1,74 (1H, m, H-6), 1,65 (1H, m, H-1) , 1,62 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H-11), 1,45 (2H, m, H2-2), 1,33 (1H, m, H-3), 1,25 (1H, m , H-6), 1,16 (1H, m, H-3), 1,10 (1H, m, H-5), 0,85 (3H, s, H3-19), 0,78 (3H, s, H3-18), 0,68 (3H, s, H3-20)); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δC 191,3 (C-15, d), 164,9 (C-13, s), 148,1 (C-8, s), 127,1 (C-14, d), 106,3 (C-17). , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,0 (C-3, t), 39,7 (C-12, t), 39,5 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,2 (C-7, t), 33,5 (C-4, s), 33,5 (C-19, q), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-18, q), 21,2 (C-11, t), 19,3 (C-2, t), 17,6 (C-16, q), 14,4 (C-20, q); ESI MS: berechnet für C20H32NaO, m/z 311,2345 [M + Na]+, gefunden 311,2352.

Eine Mischung aus ACP (25 mg, 1,0 Äquiv.), 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBt) (1,5 Äquiv.), N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDCI) (1,5 Äquiv.), Aminderivat (1,5 Äquiv.) in CH2Cl2 (0,1 M) wurde 5 Minuten bei 0 °C gerührt und dann N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA) (3 Äquiv.) langsam zu der Mischung gegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 15 Minuten bei 0 °C gerührt und dann 24 Stunden bei Raumtemperatur weitergerührt. Dann wurde die Reaktion mit wässriger 1 N Salzsäurelösung gequencht und mit EtOAc (× 3) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen und mit MgSO4 (s) getrocknet, um eine Rohfraktion zu erhalten, die durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie weiter gereinigt und entweder mit EtOAc:Hexan oder CH2Cl2:Hexan eluiert wurde, um die Amidderivate von zu liefern AKP 4a–4r.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 4a (17,2 mg, 67 %) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +44,0 (c 1,69 CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3298, 3078, 2927, 2866, 2843, 1660, 1630, 1548, 1458, 1442, 1410, 1387, 1365, 1262, 1181, 886, 863, 737, 673 cm ‒1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δH 5,49 (1H, br s, H-14), 4,81 (1H, br s, H2-17), 4,47 (1H, br s, H2-17), 2,81 (3H, d , J = 5,0 Hz, H3-1ʹ), 2,36 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,21 (1H, ddd, J = 14,0, 9,0, 4,0 Hz, H2-12) , 2,12 (3H, d, J = 2,0 Hz, H3-16), 1,96 (1H, m, H2-7), 1,87 (1H, m, H-12), 1,73 (1H, m, H2-1), 1,73 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,60 (1H, m, H2-2), 1,57 (1H, m, H-9), 1,53 (1H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2-11), 1,43 (1H, m, H2-3), 1,30 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td , J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,05 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-5), 0,96 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,85 (3H, s, H3-18), 0,78 (3H, s, H3-19), 0,66 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δC 168,0 (C-15, s), 154,8 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,6 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,5 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 26,0 (C-1ʹ, q), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,2 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C21H35NNaO, m/z 340,2610 [M + Na]+ gefunden 340,2610.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (5:95) als Elutionsmittel gereinigt, um 4b (21,4 mg, 78 %) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +38,3 (c 1,98, CHCl3); FTIR (unverdünnt) Ѵmax: 3293, 3078, 2926, 2866, 2844, 1660, 1630, 1536, 1459, 1442, 1388, 1365, 1256, 1178, 988, 915, 887 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,86 (1H, m, H-2ʹ), 5,53 (1H, dd, J = 2,4, 1,2 Hz, H-14), 5,20 (1H, m, H2-3ʹ), 5,13 (1H, m, H2-3ʹ), 4,83 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,49 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,92 (2H, tt, J = 6,0, 1,6 Hz, H2-1ʹ), 2,3389 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 (1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,4 Hz, H2-12) , 2,16 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,67 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td , J = 13,4, 4,2 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 12,0, 2,7 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166,9 (C-15, s), 155,6 (C-13, s), 148,5 (C-8, s) 134,6 (C-2ʹ, d), 117,5 (C-14, d), 116,3 (C-3ʹ, t), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-1ʹ, t), 41,6 ( C-3, t), 39,7 (C-12, t), 39,6 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-4, s ), 33,6 (C-18, q), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 (C -16, q), 14,5 (C-20, q)); ESI-TOF MS: berechnet für C23H37NNaO, m/z 366,2767 [M + Na]+, gefunden 366,2766.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (5:95) als Elutionsmittel gereinigt, um 4c (21,1 mg, quantitative Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +32,9 (c 1,69, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3309, 2927, 2847, 1662, 1637, 1527, 1459, 1442, 1387, 1366, 1253, 1176, 1115, 886 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,59 (1H, br s, NH), 5,51 (1H, br d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,83 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17 ), 4,48 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,10 (2H, dd, J = 5,6, 2,8 Hz, H2-1ʹ), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz , H2-7), 2,26 (1H, dd, J = 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,23 (1H, t, J = 2,8 Hz, H-3ʹ), 2,16 (3H, d, J = 1,2 Hz , H3-16), 1,97 (1H, dd, J = 13,0, 5,0 Hz, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,64 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H2-2) , 1,45 (1H, m, H-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0 , 4,4 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 13,0, 2,8 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s , H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166,6 (C-15, s), 156,9 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,8 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 79,9 (C-2ʹ, s), 71,4 (C-3ʹ, d), 56,0 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,66 (C-10, s), 39,65 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 28,9 (C-1ʹ, t), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 ( C-16, q), 14,5 (C-20, q). ESI-TOF MS: berechnet für C23H36NO, m/z 342,2791 [M + H]+, gefunden 342,2794.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (10:90) als Elutionsmittel gereinigt, um 4d (26,9 mg, 80 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+28,2 (c 2,51, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3293, 3078, 2924, 2851, 1659, 1628, 1542, 1459, 1441, 1387, 1365, 1259, 887 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,5 (1H, d, J = 1,2 Hz, H-14), 5,39 (1H, br s, NH), 4,83 (1H, d, J = 1,5 Hz, H2-17) , 4,49 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,27 (2H, m, H2-1ʹ), 2,38 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,23 ( 1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,14 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,90 (1H, m , H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,53‒1,47 (2H, m, H-2'), 1,49 (2H, m, H2-2/H2-2ʹ), 1,45 (1H, m, H2-11) , 1,39 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, m, H2-6), 1,32‒1,25 (10H, m, H-3ʹ/H-4ʹ/ H-5ʹ/H-6ʹ/H-7ʹ ), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H-3), 1,08 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz , H-1), 0,88 (3H, m, H3-8ʹ), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 154,7 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,9 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,2 (C-1ʹ, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 31,8 (C-6ʹ, t), 29,8 (C-2ʹ, t), 29,3 (C-4ʹ, t), 29,2 (C-5ʹ, t), 27,0 (C-3ʹ, t), 24,5 (C-6, t), 22,6 ( C-7ʹ, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11), 19,3 (C-2), 18,3 (C-16, q), 14,5 (C-20, q), 14,1 ( C-8ʹ, q). ESI-TOF MS: berechnet für C28H49NNaO, m/z 438,3706 [M + Na]+, gefunden 438,3695.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (5:95) als Elutionsmittel gereinigt, um 4e (16,7 mg, 54 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben.\ ({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +35,2 (c 0,69, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3308, 2927, 2845, 1661, 1641, 1598, 1541, 1499, 1440, 1387, 1309, 1252, 1152, 1079, 888, 752, 691 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,55 (1H, d, J = 7,6 Hz, H-2ʹ), 7,32 (3H, m, H-3ʹ/H-4ʹ/H-5ʹ), 7,08 (1H, br t , J = 7,6 Hz, H-6ʹ), 5,66 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,82 (1H, d, J = 1,1 Hz, H2-17), 4,52 (1H, br s, H2-17), 2,40 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 13,0, 10,4, 1,2 Hz, H2-12), 2,22 (3H, d , J = 1,2 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,95 (1H, m, H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,74 (1H, m, H2-6), 1,71 (1H, m, H2-11), 1,61 (1H, m, H2-2), 1,58 (1H, m, H-9), 1,53 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,18 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,02 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3 -18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,70 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δC 165,0 (C-15, s), 157,9 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 138,3 (C-1ʹ, s), 129,0 (C-4ʹ , d), 124,0 (C-3ʹ/C-5ʹ, d), 119,7 (C-2ʹ/C-6ʹ, d), 117,9 (C-14, d), 106,4 (C-17), 56,1 (C- 9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,9 (C-12, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,4 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11 , t), 19,4 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI MS: Berechnet für C26H37NNaO, m/z 402,2767 [M + Na]+, gefunden 402,2779.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (10:90) als Elutionsmittel gereinigt, um 4f (30,7 mg, 97 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +31,0 (c 0,70, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3295, 2925, 2843, 1657, 1631, 1536, 1454, 1387, 1365, 1255, 1175, 887, 697 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,31‒7,27 (5H, m, H-2ʹ/H-3ʹ/H-4ʹ/H-5ʹ/H-6ʹ), 5,63 (1H, br s, NH), 5,53 ( 1H, d, J = 1,1 Hz, H-14), 4,83 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17), 4,48 (1H, s, H2-17), 4,47 (2H, m, H2-7ʹ ), 2,36 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 (1H, ddd, J = 13,0, 10,4, 1,2 Hz, H2-12), 2,18 (3H, d, J = 1,1 Hz, H3-16), 1,96 (1H, m, H2-7), 1,89 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6 ), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,59 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H2-2), 1,44 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,31 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2 -3), 1,08 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18) , 0,80 (3H, s, H3-19), 0,67 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,9 (C-15, s), 156,9 (C-13, s), 149,4 (C-8, s), 139,5 (C-1ʹ, s), 129,5 (C-3ʹ /C-5ʹ, d), 128,7 (C-2ʹ/C-6ʹ, d), 128,2 (C-4ʹ, d), 118,2 (C-14, d), 107,0 (C-17, t), 56,5 ( C-9, d), 55,8 (C-5, d), 43,6 (C-7ʹ, t), 42,4 (C-3, t), 39,99 (C-10, s), 39,90 (C-12, t ), 39,3 (C-1, t), 38,6 (C-7, t), 33,8 (C-4, s), 33,8 (C-18, q), 24,6 (C-6, t), 21,9 (C -19, q), 21,7 (C-11, t), 19,5 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14,6 (C-20, q). ESI-TOF MS: berechnet für C27H39NNaO, m/z 416,2924 [M + Na]+, gefunden 416,2940.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (20:80) als Elutionsmittel gereinigt, um 4 g (29,1 mg, 91 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +33,3 (c 0,71, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3312, 3077, 2925, 2866, 2843, 1661, 1641, 1599, 1571, 1524, 1459, 1437, 1387, 1365, 1234, 1153, 887, 750, 692 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,54 (1H, ddd, J = 4,0, 1,6, 0,4 Hz, H-6ʹ), 7,67 (1H, td, J = 8,0, 2,0 Hz, H-4ʹ), 7,30 (1H , d, J = 8,0 Hz, H-3ʹ), 7,20 (1H, ddd, J = 4,0, 1,6, 0,8 Hz, H-5ʹ), 6,60 (1H, br s, NH), 5,65 (1H, br d, J = 1,3 Hz, H-14), 4,84, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,61 (1H, br s, H2-7ʹ), 4,60 (1H, br s, H2-7ʹ), 4,50 ( 1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 16,0, 10,4, 1,2 Hz, H2 -12), 2,17 (3H, d, J = 1,2 Hz, H3-16), 1,98 (1H, dd, J = 13,0, 2,4 Hz, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,66 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H -9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,4, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0 , 5,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 156,8 (C-2ʹ, s), 155,6 (C-13, s), 149,0 (C-6ʹ, d), 148,5 (C-8 , s), 136,8 (C-4ʹ, d), 122,31 (C-3ʹ, d) 122,24 (C-5ʹ, d), 117,6 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 56,1 ( C-9, d), 55,5 (C-5), 44,3 (C-7ʹ, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-4, s), 33,6 (C-18, q), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19 , q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,4 (C-16, q), 14,5 (C-20, q). ESI-TOF MS: berechnet für C26H38N2NaO, m/z 417,2876 [M + Na]+, gefunden 417,2893.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (20:80) als Elutionsmittel gereinigt, um 4h (33 mg, 91 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +26,2 (c 2,21, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3299, 2928, 2845, 1689, 1641, 1521, 1457, 1440, 1387, 1365, 1254, 1230, 887, 740 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8,30 (1H, br s, NH-Tryptamin), 7,61 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7ʹ Tryptamin), 7,37 (1H, d, J = 8,0 Hz, H -4ʹ Tryptamin), 7,21 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-5ʹ Tryptamin), 7,11 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-6ʹ Tryptamin), 7,03 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2ʹ Tryptamin), 5,49 (1H, br s, NH), 5,43 (1H, br s, H-14), 4,81 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,47 (1H, br s , H2-17), 3,63 (2H, ddd, J = 7,0, 5,0, 2,0 Hz, H2-α-Tryptamin), 2,99 (2H, t, J = 7,0 Hz, H2-β-Tryptamin), 2,37 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 3,0 Hz, H2-7), 2,20 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,14 (3H, d, J = 0,8 Hz, H3-16), 1,95 (1H, m, H2-7), 1,86 (1H, m, H2-12), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,70 (1H, m, H2-6), 1,63 (2H, m, H2-11), 1,57 (1H, m, H2-2), 1,54 (1H, m, H-9), 1,48 (1H, m, H2-2), 1,43 (1H, m, H2-11), 1,38 (1H, m, H2-3), 1,31 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,16 (1H, td, J = 12,0, 4,1 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dd, J = 12,0, 2,4 Hz, H-5), 0,99 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3 -19), 0,67 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,2 (C-15, s), 155,0 (C-13, s), 148,6 (C-8, s), 136,4 (C-7ʹa, s), 127,4 (C-3ʹa , s), 122,1 (C-2ʹ, d), 122,1 (C-6ʹ, d), 119,4 (C-5ʹ, d), 118,9 (C-7ʹ, d), 117,8 (C-14, d), 113,1 (C-3ʹ, s), 111,3 (C-4', d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3 , t), 39,7 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,4 (C-α, d), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 25,5 (C-β, t), 24,2 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, d), 19,4 (C-2), 18,3 (C-16, q), 14,4 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C30H42N2NaO, m/z 469,3189 [M + Na]+, gefunden 469,3197.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (20:80) als Elutionsmittel gereinigt, um 4i (19 mg, 71 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +37,5 (c 1,54, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3176, 2931, 2843, 1638, 1507, 1459, 1440, 1387, 1366, 1255, 1201, 1076, 1048, 887, 788 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,50 (1H, br s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 4,49 (1H, s, H2-17), 3,77 ( 3H, s, OCH3), 2,38 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,4 Hz, H2-12), 2,17 (3H , d, J = 1,1 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,94 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,59 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,49 (1H, m, H-2) , 1,48 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,2 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0 , 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,0, 2,4 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 12,8, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s , H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 171,0 (C-15, s), 148,4 (C-13/C-8, s), 113,0 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 64,7 (OCH3, q), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,9 (C-10, s), 39,7 (C-12, t) , 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, s), 33,59 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C- 19, s), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,8 (C-16, s), 14,5 (C-20, s); ESI-TOF MS: berechnet für C21H35NNaO2, m/z 356,2560 [M + Na]+, gefunden 356,2565.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (40:80) als Elutionsmittel gereinigt, um 4j (4,7 mg, 20 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+33,5 (c 0,55, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3212, 2925, 2843, 1641, 1459, 1442, 1387, 1366, 1087, 1031, 887, 861, 738 cm‒1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,45 (1H, br s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,3 Hz, H2-17), 4,47 (1H, br s, H2-17), 2,38 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 14,0, 10,0, 5,0 Hz, H2-12), 2,18 (3H, br s, H3-16) , 1,97 (1H, m, H-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m , H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,3, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H , dd, J = 10,0, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 166,5 (C-15, s), 158,7 (C-13, s), 148,3 (C-8, s), 112,3 (C-14, d), 106,4 (C-17 , t), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,72 (C-12, t), 39,70 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C, C-4, s), 24,4 (C-6, t), 22,6 (C- 19, q), 21,7 (C-11, t), 19,3 (C-16, q), 18,9 (C-2, t), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C20H34NO2, m/z 320,2584 [M + H]+, gefunden 320,2583.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (20:80) als Elutionsmittel gereinigt, um 4k (9,8 mg, 40 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +35,5 (c 1,16, CHCl3); FTIR (unverdünnt) Ѵmax: 3240, 2924, 2865, 2844, 1655, 1624, 1542, 1458, 1440, 1386, 1365, 1289, 1194, 1006, 887, 851, 685 cm‒1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,48 (1H, s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,3 Hz, H2-17), 4,47 (1H, br s, H2-17), 2,38 ( 1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,27 (1H, ddd, J = 14,0, 10,0, 5,0 Hz, H2-12), 2,18 (3H, br s, H3-16), 1,97 (1H, m, H-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,55 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,3, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 10,0, 3,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 12,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3 -19), 0,68 (3H, s, H3-20);13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 163,0 (C-15, s), 157,1 (C-13, s), 148,4 (C-8, s) , 114,6 (C-14, d), 106,3 (C-17, t), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,67 (C- 10, s), 39,6 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 21,7 (C-19, q), 21,6 (C-11, t), 19,4 (C-16, q), 18,6 (C-2, t), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C20H34N2O, m/z 341,2563 [M + H]+, gefunden 341,2553.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (10:90) als Elutionsmittel gereinigt, um 4 l (22,9 mg, 74 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) +11,8 (c 1,06 CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3197, 2925, 2849, 1661, 1642, 1456, 1441, 1387, 1365, 1257, 1204, 1113, 1037, 1064, 1021, 951, 895, 875, 817 cm ‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,49 (1H, br s, H-14), 4,94 (1H, br s, H-1ʹ), 4,82 (1H, s, H2-17), 4,47 (1H, s, H2-17), 3,95 (1H, t, J = 9,0 Hz, H2-5ʹ), 3,63 (1H, m, H2-5ʹ), 2,37 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,4 Hz, H2 -7), 2,25 (1H, ddd, J = 14,0, 10,1, 4 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 1,0 Hz, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7) , 1,93 (1H, m, H2-12), 1,81 (2H, m, H2-2ʹ/H2-3ʹ), 1,74 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,63 (1H, m, H2-4ʹ), 1,58–1,53 (2H, m, H2-3ʹ/H2-4ʹ), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,54 (1H, m, H-9), 1,48 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,38 (1H, m, H2-3), 1,30 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,16 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dt, J = 12,0, 2,0 Hz, H-5), 0,99 (1H , br t, J = 12,0 Hz, H2-1), 0,86 (3H, s, H3-18), 0,79 (3H, s, H3-19), 0,67 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 158,0 (C-15, s), 158,0 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 148,4 (C-13, s), 113,2 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 102,6 (C-1ʹ, d), 62,6 (C-5ʹ, t), 56,0 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,0 (C-3, t), 39,8 (C-10, s), 39,6 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C-4, s), 28,1 (C-2ʹ, t), 25,0 (C-4ʹ, t), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,4 ( C-11, t), 19,3 (C-2, t), 18,67 (C-3ʹ, t), 18,66 (C-16, q), 14,4 (C-20, q). ESI-TOF MS: berechnet für C25H41NNaO3, m/z 426,2979 [M + Na]+, gefunden 426,2969.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (98:2) als Elutionsmittel gereinigt, um 4m (22,6 mg, 85 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +31,9 (c 2,11, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 2925, 2848, 1651, 1629, 1458, 1442, 1388, 1371, 1265, 1131, 1056, 887, 852 cm‒1. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 5,76 (1H, d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,50 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17), 3,02 (3H, s, H3-1ʹʹ), 2,98 (3H, s, H3-1ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,24 ( 1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,93 (1H, m, H2-12), 1,90 (3H, d, J = 1,2 Hz , H3-16), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-7), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H-9), 1,50 1,58 (1H, m, H-9), 1,55 (1H, m, H2-2), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m , H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,08 (1H, dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20). 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 168,8 (C-15, s), 149,9 (C-13, s), 148,5 (C-8, s), 117,4 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,6 (C-12, t), 38,3 (C-7, t), 37,8 (C-1ʹʹ, q), 34,7 (C-1ʹ, q), 33,61 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,4 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,5 (C-16, q), 14,5 ( C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C22H38NO, m/z 322,2948 [M + H]+, gefunden 332,2949.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 4n (20,3 mg, 68 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +24,9 (c 2,08, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3077, 2932, 2848, 1626, 1440, 1381, 1255, 1228, 1137, 1124, 1021, 886, 850 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,72 (1H, d, J = 0,8 Hz, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,6 Hz, H2-17), 4,51 (1H, br s, H2- 17), 3,59 (1H, m, H2-a), 3,45 (1H, m, H2-a), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,4 Hz, H2-7), 2,22 (1H, ddd , J = 14,0, 9,5, 4,3 Hz, H2-7), 1,94 (2H, m, H2-12), 1,83 (3H, br s, H3-16), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m, H2-c), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,63 (1H, m, H2-6), 1,61 (1H, m, H2-b), 1,58 (2H, m, H2 -c/H-9), 1,55 (1H, m, H2-2), 1,53 (1H, m, H2-b), 1,52 (1H, m, H2-b), 1,49 (1H, m, H2-2 ), 1,47 (2H, m, H2-11), 1,39 (1H, br d, J = 13,0 Hz, H2-3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,17 ( 1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,07 (1H, dd, J = 13,0, 2,4 Hz, H-5), 1,00 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1 ), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,69 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167,5 (C-15, s), 148,4 (C-8, s), 147,9 (C-13, s), 118,1 (C-14, d), 106,4 (C-17 , t), 56,1 (C-9, d), 55,6 (C-5, d), 47,4 (Ca von Piperidin, t), 42,21 (Ca von Piperidin, t), 42,16 (C-3, t), 39,7 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,4 (C-12, t), 38,2 (C-7, t), 33,64 (C-18, q), 33,58 (C-4, s), 26,7 (Cb von Piperidin, t), 25,7 (Cb von Piperidin, t), 24,7 (Cc von Piperidin, t), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,3 ( C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,5 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C25H41NNaO, m/z 394,3080 [M + Na]+, gefunden 394,3070.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 4o (29,4 mg, quantitative Ausbeute) als farbloses Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +29,6 (c 2,61, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 2933, 2844, 1656, 1634, 1458, 1441, 1387, 1366, 1319, 1175, 1003, 887 cm‒1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 6,08 (1H, s, H-14), 4,86 ​​(1H, br s, H2-17), 4,53 (1H, br s, H2-17), 3,68 (3H, s, OCH3), 3,20 (3H, s, H3-1ʹ), 2,40 (1H, ddd, J = 12,0, 4,0, 3,0 Hz, H2-7), 2,30 (1H, ddd, J = 14,0, 9,0, 4,0 Hz, H2 -12), 2,13 (3H, d, J = 1,1 Hz, H3-16), 2,06–1,91 (2H, m, H2-7/H2-12), 1,78 (1H, m, H2-1), 1,74 ( 1H, m, H2-11), 1,65 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2- 11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,20 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,0, 2,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3-18), 0,81 (3H , s, H3-19), 0,70 (3H, s, H3-20); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ 168,3 (C-15, s), 157,2 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 113,7 (C-14, d), 106,3 (C-17 , t), 61,4 (OCH3, q), 56,0 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 40,0 (C-12, t), 39,7 (C -10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,59 (C-18, q), 33,57 (C-4, s), 32,0 (C-1ʹ, q) , 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,6 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,7 (C-16, q), 14,5 (C- 20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C22H37NNaO2, m/z 370,2717 [M + Na]+, gefunden 370,2741.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (99:1) als Elutionsmittel gereinigt, um 4p (27,5 mg, 51 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +38,8 (c 0,42, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax:3170, 3078, 2926, 2843, 1764, 1687, 1643, 1597, 1440, 1387, 1201, 1110, 965, 886, 742 cm‒1. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,73 (1H, br s, NH), 5,68 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,85 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17) , 4,50 (1H, s, H2-17), 3,35 (3H, s, H3-1ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,28 (H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,04 (3H, s, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-12), 1,94 (1H, m, H2-7), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,73 (1H, m, H2-6), 1,66 (1H, m, H2-11), 1,60 (1H, m, H2-2). 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (H, m, H2-2), 1,47 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, dd, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-6), 1,18 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 12,0, 4,0 Hz, H-5), 1,01 ( 1H, td, J = 13,0, 4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 163,5 (C-15, s), 148,4 (C-13/C-8, s), 114,9 (C-14, d), 106,4 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,5 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 40,0 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 36,3 (C-1ʹ, q), 33,6 (C-18, q), 33,59 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 ( C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,7 (C-16, q), 14,5 (C-20, q). ESI-TOF MS: berechnet für C21H35NNaO2, m/z 356,2560 [M–H]+, gefunden 356,2564.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus EtOAc:Hexan (10:90) als Elutionsmittel gereinigt, um 4q (22,3 mg, 74 % Ausbeute) als gelbes Öl zu ergeben. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{26}\) ​​+ 29,0 (c 0,88, CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3314, 2928, 2865, 2844, 1754, 1661, 1638, 1638, 1532, 1438, 1366, 1205, 1175, 887 cm‒1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,86 (1H, br s, NH), 5,59 (1H, br s, H-14), 4,84 (1H, d, J = 1,4 Hz, H2-17), 4,49 (1H , d, J = 1,0 Hz, H2-17), 4,10 (2H, d, J = 5,2 Hz, H2-2ʹ), 3,77 (3H, s, OCH3), 2,39 (1H, ddd, J = 12,0, 4,4, 2,4 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 12,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 0,8 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,92 (1H, m, H2-12), 1,76 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,65 (1H, m, H2-6), 1,5589 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,46 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2 -3), 1,32 (1H, dd, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-6), 1,17 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,09 (1H, dd, J = 13,0, 3,0 Hz, H-5), 1,01 (1H, td, J = 13,0, 4,4 Hz, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 ( 3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 170,8 (C-1ʹ, s), 167,0 (C-15, s), 156,8 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,9 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 52,3 (OCH3, q), 42,1 (C-3, t), 41,0 (C -2ʹ, t), 39,7 (C-12, t), 39,68 (C-10, s), 39,1 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q) , 33,6 (C-4, s), 24,5 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,5 ( C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C23H37NNaO3, m/z 398,2666 [M + Na]+, gefunden 398,2660.

Der rohe Rückstand wurde an Kieselgel vorabsorbiert und durch Flash-Kieselgel-Säulenchromatographie unter Verwendung einer Mischung aus CH2Cl2:MeOH (95:5) als Elutionsmittel gereinigt, um 4r (22,4 mg, 72 % Ausbeute) als farbloses Öl zu ergeben.\ ({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{27}\) +30,5 (c 1,41 CHCl3); FTIR (unverdünnt) Ѵmax: 3313, 2928, 2844, 1750, 1661, 1638, 1524, 1460, 1443, 1373, 1263, 1195, 1178, 1025, 886, 863, 736 cm‒1; 1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δH 5,94 (H, br s, NH), 5,60 (H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,85 (1H, d, J = 1,2 Hz, H2-17) , 4,50 (1H, s, H2-17), 4,23 (2H, q, J = 7,0 Hz, H2-3ʹ), 4,08 (2H, d, J = 5,0 Hz, H2-2ʹ), 2,39 (1H, ddd, J = 13,0, 4,0, 2,0 Hz, H2-7), 2,26 (1H, ddd, J = 13,0, 10,0, 4,0 Hz, H2-12), 2,15 (3H, d, J = 1,0 Hz, H3-16), 1,98 (1H, m, H2-7), 1,94 (1H, m, H2-12), 1,78 (1H, m, H2-1), 1,72 (1H, m, H2-6), 1,68 (1H, m, H2-11), 1,61 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,48 (1H, m, H2-11), 1,40 (1H, m, H2-3), 1,33 (1H, m, H-6), 1,30 (3H, t, J = 7,0 Hz, H3-4ʹ), 1,21 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-3), 1,10 (1H, dd, J = 12,0, 3,0 Hz, H-5), 0,99 (1H, td, J = 13,0, 4,0 Hz, H2-1), 0,88 (3H, s, H3-18 ), 0,81 (3H, s, H3-19), 0,69 (3H, s, H3-20); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δC 170,3 (C-1ʹ, s), 167,0 (C-15, s), 156,5 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 117,0 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 61,4 (C-3ʹ, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 41,2 (C-2ʹ, t), 39,68 (C-12, t), 39,65 (C-10, s), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,5 (C-18, q), 33,5 (C-4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,3 (C-2, t), 18,4 ( C-16, q), 14,4 (C-20, q), 14,1 (C-4ʹ, q); ESI-TOF MS: berechnet für C24H39NNaO3, m/z 412,2822 [M + Na]+, gefunden 412,2836.

Eine Mischung aus 4r (16,5 mg, 0,04 mmol, 1,0 Äquiv.) und Lithiumhydroxid-Monohydrat (2,1 mg, 0,5 mmol, 1,2 Äquiv.) wurde in THF:MeOH:H2O (0,4 ml, 0,1 M) gelöst. Man ließ die Reaktion 4 Stunden lang bei Raumtemperatur rühren und dann wurden MeOH und THF unter Vakuum entfernt. Das Rohprodukt wurde mit H2O verdünnt und mit EtOAc extrahiert und die organische Schicht wurde verworfen. Die wässrige Schicht wurde mit 1 N Salzsäurelösung auf einen pH-Wert von etwa 3 angesäuert und dann mit EtOAc extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit Kochsalzlösung gewaschen, über Mg2SO4 (s) getrocknet und unter Vakuum getrocknet, um 4s (11,7 mg, quantitative Ausbeute) als farbloses Öl zu ergeben. Die Zielverbindung wurde als gelbes Öl in quantitativer Ausbeute erhalten. \({[\mathrm{\alpha }]}_{D}^{25}\) + 20,7 (c 0,83 CHCl3); FTIR (sauber) Ѵmax: 3336, 2926, 2867, 1715, 1662, 1541, 1457, 1441, 1388, 1366, 1261, 1218, 1087, 888, 733 cm‒1; 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,11 (1H, br s, NH), 5,61 (1H, br s, H-14), 4,84 (1H, br s, H2-17), 4,48 (1H, br s, H2-17), 4,10 (2H, br s, H2-2ʹ), 2,39 (1H, br d, J = 12,0 Hz, H2-7), 2,25 (1H, br d, J = 12,0 Hz, H2-12) , 2,15 (3H, s, H3-16), 1,97 (1H, m, H2-7), 1,91 (1H, m, H2-12), 1,75 (1H, m, H2-1), 1,71 (1H, m , H2-6), 1,65 (1H, m, H2-11), 1,58 (1H, m, H2-2), 1,56 (1H, m, H-9), 1,50 (1H, m, H2-2), 1,45 (1H, m, H2-11), 1,39 (1H, m, H2-3), 1,32 (1H, m, H2-6), 1,17 (1H, m, H2-3), 1,08 (1H, br d , J = 12,0 Hz, H-5), 1,00 (1H, m, H2-1), 0,87 (3H, s, H3-18), 0,80 (3H, s, H3-19), 0,68 (3H, s, H3-20); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 172,9 (C-1ʹ, s), 167,9 (C-15, s), 158,0 (C-13, s), 148,4 (C-8, s), 116,5 (C-14 , d), 106,3 (C-17, t), 56,1 (C-9, d), 55,4 (C-5, d), 42,1 (C-3, t), 41,1 (C-2ʹ, t), 39,8 (C-10, s), 39,7 (C-12, t), 39,0 (C-1, t), 38,3 (C-7, t), 33,6 (C-18, q), 33,6 (C, C- 4, s), 24,4 (C-6, t), 21,7 (C-19, q), 21,5 (C-11, t), 19,4 (C-2, t), 18,6 (C-16, q), 14,5 (C-20, q); ESI-TOF MS: berechnet für C22H36NO3, m/z 362,2690 [M + H]+, gefunden 362,2681.

Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (100 µL für adhärente Zellen und 75 µL für suspendierte Zellen) mit einer Dichte von 5.000–20.000 Zellen pro Vertiefung, abhängig von ihren Wachstumsraten, ausgesät. Anschließend ließ man anhaftende und suspendierte Zellen 24 Stunden bzw. 30 Minuten bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 wachsen. Der Zytotoxizitätstest wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens Zellkulturmedium, das die getestete Verbindung in vorgegebenen Konzentrationen enthielt, eingeleitet. Nach 48-stündiger Exposition wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe des MTT-Tests für adhärente Zellen51,52 oder des XTT-Tests für suspendierte Zellen53 bestimmt. Kurz gesagt, für adhärente Zellen wurden 100 µL des MTT-Reagens in jede Vertiefung gegeben und die Mikrotiterplatten wurden 2,5–4 Stunden lang weiter inkubiert. Anschließend wurde das Medium durch 100 µL DMSO ersetzt, um das violette Formazan aufzulösen, bevor die Absorption bei 550 nm mit einem Mikroplattenlesegerät (SpectraMax Plus 384) mit einer Referenzwellenlänge von 650 nm gemessen wurde. Für suspendierte Zellen wurden 75 µL des XTT-Reagenzes in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden weitere 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurde die Absorption von orangefarbenem Formazan bei 492 nm mit einer Referenzwellenlänge von 690 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts gemessen. Der IC50-Wert wurde schließlich aus der Dosis-Wirkungs-Kurve als die Konzentration berechnet, die das Zellwachstum im Vergleich zur Negativkontrolle nach 48-stündiger Exposition gegenüber jeder getesteten Verbindung um 50 % hemmt.

Annexin V- und 7-AAD-Doppelfärbung wurde verwendet, um apoptotische und nicht-apoptotische Zelltodmodi zu unterscheiden. Kurz gesagt wurden MDA-MB-231-Zellen in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen mit 1 × 106 Zellen/Vertiefung ausgesät und 24 Stunden lang in einem CO2-Inkubator belassen. Anschließend wurden die Zellen 24–48 Stunden lang mit den getesteten Verbindungen behandelt. DMSO wurde als Vehikel verwendet und seine Endkonzentration wurde während der gesamten Studie bei 0,2 % (v/v) gehalten. Die behandelten Zellen wurden durch Trypsinisierung geerntet und einer Annexin V/7-AAD-Doppelfärbung mit dem Muse® Annexin V & Dead Cell Kit wie zuvor beschrieben unterzogen54. Die gefärbten Zellen wurden mittels durchflusszytometrischer Technik unter Verwendung des Muse® Cell Analyzer analysiert. Die Population von Annexin V-positiven Zellen wurde als frühe apoptotische Zellen definiert, und die Population, die sowohl für Annexin V als auch für 7-AAD positiv war, wurde als späte apoptotische Zellen definiert. Charakteristisch für den apoptotischen Zelltod sind die aufeinanderfolgenden Ereignisse zunehmender früher und später apoptotischer Zellpopulationen im Laufe der Zeit.

MDA-MB-231-Zellen in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen (1 × 106 Zellen/Vertiefung) wurden 24 Stunden lang mit den getesteten Verbindungen behandelt. Dann wurden die Zellen geerntet und eine Western-Blot-Analyse verwendet, um Veränderungen der Zielproteine ​​in den behandelten Zellen nachzuweisen, wie zuvor beschrieben55. Kurz gesagt, die Zellen in Kulturplatten mit 6 Vertiefungen wurden in RIPA-Zelllysepuffer, ergänzt mit einem Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail, abgekratzt, bevor sie durch Ultraschallbehandlung lysiert wurden. Zelllysate wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Gesamtproteine ​​(20 μg) in den Zelllysaten wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf PVDF-Membranen geblottet. Die Membranen wurden mit 3 % (w/v) BSA blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, die spezifisch für die folgenden Proteine ​​sind: EGFR, Phospho-EGFR (Y845), FAK, Phospho-FAK (Y397), Akt, Phospho -Akt (S473), ERK und Phospho-ERK (T202/Y204). Anschließend wurden die Membranen 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Banden spezifischer Proteine ​​wurden mithilfe von SuperSignal™ ECL-Substraten nachgewiesen und auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht.

Die iGEMDOCK v2.1-Software56 mit genauer Docking-Einstellung wurde verwendet, um molekulares Docking durchzuführen und die mögliche Bindung zwischen 4l und FAK vorherzusagen. Die Molekülstruktur von 4l wurde auf der B3LYP/6-31G*-Ebene unter Verwendung von Gaussian09 ermittelt. Die Proteinstrukturen der FERM-Domäne (PDB:2AL6) und der Kinasedomäne (PDB-ID: 2JKK) von FAK wurden von der Proteindatenbank (http://www.rcsb.org/) erhalten. Zur Analyse und Darstellung der Andockergebnisse wurde der BIOVIA Discovery Studio Visualizer57 verwendet.

Drogenähnliche Eigenschaften und Lipinskis Fünferregel wurden mithilfe der Website-Dienste von SwissADME untersucht58,59.

ACP ist ein Labdan-Diterpenoid, das in großen Mengen aus K. elegans gewonnen werden konnte. Mit seiner attraktiven Struktur als Ausgangspunkt für die Optimierung neuartiger bioaktiver Wirkstoffe auf Naturstoffbasis wurde eine Reihe von 21 ACP-Derivaten synthetisiert und auf ihre zytotoxische In-vitro-Aktivität gegen eine Reihe von Krebszelllinien untersucht. ACP und die meisten seiner Derivate zeigten eine moderate Aktivität. Interessanterweise zeigte Verbindung 4l eine bemerkenswerte zytotoxische Aktivität gegen die dreifach negative Brustkrebszelllinie MDA-MB-231. Weitere mechanistische Studien ergaben, dass FAK ein potenzielles Ziel der Verbindung 4l in MDA-MB-231-Brustkrebszellen ist, und die FAK-Hemmung schien der Mechanismus zu sein, der der Induktion des nicht-apoptotischen Zelltods in mit 4l behandelten Zellen zugrunde liegt. Eine In-silico-Studie legt nahe, dass 4l möglicherweise die FAK-Aktivierung hemmen könnte, indem es an die ATP-Bindungstasche der FAK-Kinasedomäne bindet, was zur Unterdrückung der Tyr397-Autophosphorylierung von FAK führt. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht, der die FAK-hemmende Aktivität des ACP-Derivats nachweist. Die aus dieser Arbeit gewonnenen Daten sind wichtig für die weitere Entwicklung naturstoffbasierter bioaktiver Wirkstoffe zur Behandlung des dreifach negativen Brustkrebses auf Basis des ACP-Gerüsts.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Daten sind in den Zusatzinformationen verfügbar. Dazu gehörten die unbeschnittenen Filme der Western-Blot-Ergebnisse sowie die 1H-, 13CNMR- und MS-Spektren der Verbindungen 1–3 und 4a–4s.

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Diese Forschungsarbeit wurde teilweise vom Thailand Science Research and Innovation (TSRI), dem Chulabhorn Research Institute (Grant Nos. 36824/4274394, 36824/4274396 und 36827/4274407) und dem Centre of Excellence on Environmental Health and Toxicology (EHT) unterstützt. , OPS, Ministerium für Hochschulbildung, Wissenschaft, Forschung und Innovation. PC wurde vom Royal Golden Jubilee Ph.D. unterstützt. Programm, der National Research Council of Thailand (NRCT5-RGJ63023-176) und das Chulabhorn Graduate Scholarship zum Gedenken an den 84. Geburtstag Seiner Majestät König Bhumibol Adulyadej dem Großen. Die Autoren möchten außerdem Professor Dr. Wongsatit Chuakul von der Mahidol University für die Identifizierung der Pflanze sowie Pakamas Intachote, Suchada Sengsai und Busakorn Saimanee vom Chulabhorn Research Institute für die Zytotoxizitätsbewertungen danken.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Pornsuda Chawengrum und Natthaorn Luepongpatthana.

Chemisches Biologieprogramm, Chulabhorn Graduate Institute, Chulabhorn Royal Academy, Bangkok, Thailand

Pornsuda Chawengrum, Prasat Kittakoop & Somsak Ruchirawat

Programm für Angewandte Biowissenschaften, Chulabhorn Graduate Institute, Chulabhorn Royal Academy, Bangkok, Thailand

Natthaorn Luepongpatthana und Jisnuson Svasti

Labor für Naturprodukte, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand

Sanit Thongnest, Jutatip Boonsombat, Patcharin Kongwaen, Prasat Kittakoop und Somsak Ruchirawat

Kompetenzzentrum für Umweltgesundheit und Toxikologie (EHT), Büro des Ständigen Sekretärs (OPS), Ministerium für Hochschulbildung, Wissenschaft, Forschung und Innovation (MHESI), Bangkok, Thailand

Sanit Thongnest, Jutatip Boonsombat, Kriengsak Lirdprapamongkol, Prasat Kittakoop und Somsak Ruchirawat

Fachbereich Chemie, Fakultät für Naturwissenschaften, Silpakorn-Universität, Nakhon Pathom, Thailand

Jitnapa Sirirak

Labor für Biochemie, Chulabhorn Research Institute, Bangkok, Thailand

Kriengsak Lirdprapamongkol, Siriporn Keeratichamroen, Phreeranat Montatip und Jisnuson Svasti

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Konzeptualisierung, JB, KL; Datenkuration, ST, JB, JS; KL, SK formale Analyse, ST, JB, JS, KL, SK; Finanzierungsakquise, JB, KL, P.Kittakoop; Untersuchung, PC, NL, JS, JB, PK, PM; Methodik, ST, JB, JS, KL, SK; Projektverwaltung, JB, KL; Ressourcen, SR, J.Svasti; Aufsicht, SR, J.Svasti; Validierung, ST, JB, JS, KL, SK; Vorbereitung des schriftlichen Originalentwurfs, JB, KL; Schreiben-Rezension und Bearbeitung, ST, JB, JS, KL, SK, P.Kittakoop, J.Svasti, SR; Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jutatip Boonsombat oder Kriengsak Lirdprapamongkol.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Chawengrum, P., Luepongpatthana, N., Thongnest, S. et al. Das Amidderivat der Anticopalsäure induziert den nicht-apoptotischen Zelltod in dreifach negativen Brustkrebszellen, indem es die FAK-Aktivierung hemmt. Sci Rep 13, 13456 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40669-6

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Eingegangen: 25. März 2023

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 18. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40669-6

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