Bioverteilung und Racemisierung des Darms

Oct 12, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 851 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Aus Mikrobiomen gewonnene Metaboliten sind wichtig für die Mikrobiom-Darm-Hirn-Achse und die Entdeckung neuer Krankheitsbehandlungen. d-Alanin (d-Ala) kommt bei vielen Tieren als potenzieller Co-Agonist der N-Methyl-d-Aspartat-Rezeptoren (NMDAR) vor, Rezeptoren, die im Nerven- und Hormonsystem weit verbreitet sind. Das Darmmikrobiom, die Ernährung und die mutmaßliche endogene Synthese sind die potenziellen Quellen von d-Ala bei Tieren, obwohl es keine direkten Beweise für die Verteilung und Racemisierung von im Darm absorbiertem l-/d-Ala im Hinblick auf Wirt-Mikroben-Interaktionen gibt Säugetiere. In dieser Arbeit verwendeten wir keimfreie Mäuse, um die Störungen durch Mikrobiota zu kontrollieren, und isotopenmarkiertes l-/d-Ala, um deren Bioverteilung und Racemisierung in vivo zu verfolgen. Die Ergebnisse zeigten eine zeitabhängige Bioverteilung von im Darm absorbiertem d-Ala, insbesondere eine Anreicherung von im Darm absorbiertem d-Ala im Pankreasgewebe, im Gehirn und in der Hypophyse. Bei keimfreien Mäusen wurde keine endogene Synthese von d-Ala durch Racemisierung beobachtet. Als d-Ala-Quellen bei Mäusen wurden Mikrobiota und Ernährung identifiziert, nicht jedoch endogene Racemisierung. Diese Arbeit zeigt, wie wichtig es ist, die biologischen Funktionen von d-Ala aus dem Darmmikrobiom in vivo weiter zu untersuchen, insbesondere im Hinblick auf NMDAR-bezogene Aktivitäten, für d-Ala als potenzielles Signalmolekül in der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achse.

Die Untersuchung chemischer Wechselwirkungen in der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achse ist für das Verständnis und die Behandlung neurologischer Erkrankungen wie Autismus-Spektrum-Störung1, Alzheimer-Krankheit2 und Parkinson-Krankheit3 immer wichtiger geworden. Aus dem Mikrobiom stammende Metaboliten können an der chemischen Signalübertragung zwischen Zellen in verschiedenen Geweben und Organen des Wirts beteiligt sein, einschließlich des endokrinen und zentralen Nervensystems. Das Darmmikrobiom ist bekannt als Quelle einer Vielzahl bioaktiver Moleküle wie Trimethylamin-N-oxid, das mit der kardiovaskulären Gesundheit in Zusammenhang steht4, phenolischen Metaboliten, die die Neurodegeneration reduzieren5, kurzkettigen Fettsäuren im Zusammenhang mit Stoffwechselerkrankungen6 und Neurotransmittern wie γ-Aminobuttersäure das das enterische Nervensystem regulieren kann7. Die Entdeckung und Charakterisierung funktioneller Mikrobiom-abgeleiteter Metaboliten ist daher wichtig für zukünftige mikrobiombasierte Krankheitsinterventionen.

d-Alanin (d-Ala) ist ein kaum charakterisiertes, aber interessantes potenzielles mikrobielles Signalmolekül in der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achse. d-Ala ist ein wesentlicher Bestandteil der bakteriellen Zellwände, wird durch mikrobielle Alaninracemasen aus l-Ala hergestellt und kommt im Bereich der Mikroorganismen nahezu allgegenwärtig vor8. Wie D-Serin (d-Ser) interagiert d-Ala mit der Glycin-Bindungsstelle der N-Methyl-d-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs)9,10. NMDAR ist ein ionotroper Glutamatrezeptor, der in verschiedenen Zelltypen exprimiert wird, einschließlich Neuronen, wo er hauptsächlich mit erregenden Synapsen assoziiert ist11. d-Ser moduliert die NMDAR-Aktivität im Zentralnervensystem und beeinflusst so die Gehirnfunktionen, was klinische Relevanz für neurologische Störungen wie Depression und Schizophrenie zeigt12,13,14. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass d-Ala in vitro ein wirksamer, stereoselektiver Co-Agonist von NMDAR ist9,10. Mithilfe von Caenorhabditis elegans als Tiermodell zeigten die Forscher, dass d-Ala das Verhalten von Tieren über das NMDAR15 regulieren kann. Obwohl es bei höheren Tieren derzeit keine In-vivo-Beweise für die d-Ala-Funktion gibt und diese untersucht werden, deuten Hinweise darauf hin, dass d-Ala an einer Reihe von Funktionen beteiligt sein könnte, insbesondere im Nerven- und Hormonsystem. Beispielsweise schwanken die d-Ala-Spiegel sowohl in Nagetieren als auch im menschlichen Gewebe zirkadian16,17,18,19. Wie mehrere andere d-Aminosäuren (d-AAs) wird d-Ala in endokrinen Strukturen nachgewiesen, einschließlich der Insulin-sezernierenden β-Zellen in den Pankreasinseln und adrenocorticotropen Hormon-sekretierenden Zellen in der Hypophyse20,21,22,23 . Darüber hinaus wurden veränderte d-Ala-Spiegel in Proben von Personen mit verschiedenen Krankheiten wie Alzheimer, Diabetes, Nierenerkrankungen, Krebs und mehr gefunden, wie in unserem vorherigen Bericht24 zusammengefasst. Dies macht d-Ala zu einem potenziellen Biomarker und pharmakologischen Ziel für diese Krankheiten.

Überraschenderweise ist angesichts dieses Interesses der Ursprung von d-Ala bei Tieren, insbesondere bei weit verbreiteten Nagetieren, nicht bekannt. Es gibt mehrere potenzielle Quellen für d-Ala bei Tieren – Ernährung, Darmmikrobiota und endogene Synthese. Nahrung, insbesondere fermentierte und verarbeitete Lebensmittel, enthält d-Ala und kann eine Quelle für d-Ala sein25. Der mikrobielle Ursprung von d-Ala wird durch eine Reihe von Beweisen gestützt. Unsere Arbeit zeigte die d-Ala-Produktion durch isolierte Darmmikrobenarten26. Andere Gruppen haben die Expression von Alanin-Racemasen in Mikroorganismen27,28 und die Abhängigkeit der d-Ala-Spiegel von der Anwesenheit der Darmmikrobiota18,29 gezeigt. Obwohl bei Säugetieren keine endogenen Alanin-Racemasen identifiziert wurden, konzentriert sich eine interessante Hypothese auf die potenzielle Quelle von d-Ala im Speichel und in den Speicheldrüsen30,31. Diese drei Faktoren – Ernährung, Darmmikrobiota und hypothetische endogene Synthese – sind miteinander verknüpft, was es schwierig macht, den Ursprung von d-Ala in tierischen Geweben und Organen zu unterscheiden.

In dieser Studie verwendeten wir keimfreie (keine Mikrobiota) und konventionell gezüchtete Mäuse (mit normaler Mikrobiota), die beide oral mit stabil isotopenmarkiertem d/l-Ala gefüttert wurden. Hauptziele der Studie sind (1) die Identifizierung der Ursprünge von d-Ala bei Mäusen, (2) die Verfolgung der im Darm absorbierten d-Ala-Bioverteilung und (3) die Bereitstellung von Informationen über die biologischen Funktionen von d-Ala (Abb. 1). ). Durch die Verwendung keimfreier Mäuse wurde die Mikrobiota als Quelle für d-Ala eliminiert, einschließlich der damit verbundenen bakteriellen Alanin-Racemase-Aktivität. Mit stabilen Isotopen markiertes Ala lieferte direkte Beweise für die Absorption und Bioverteilung von d-Ala im Darm sowie für das Fehlen einer endogenen l-Ala-Racemisierung in unserem experimentellen Zeitraum. In den Experimenten wurden Lösungen, die d- oder l-Ala enthielten, oral über eine einmalige Sondenernährung (1-stündige Exposition) oder durch Ergänzung des Trinkwassers mit diesen Isotopen für zwei Wochen verabreicht. Diese beiden experimentellen Szenarien untersuchen die Korrelation der Bioverteilung des Metaboliten mit der kurz- und langfristigen Exposition von Tieren gegenüber exogenem l/d-Ala. Um die potenzielle endogene Synthese von d-Ala durch Racemisierung zu untersuchen, wurde mit stabilem Isotop markiertes l-Ala an keimfreie und konventionelle Mäuse verfüttert und das d-Ala-Isotopenprodukt überwacht. Die chirale Derivatisierung von Aminosäuren (AAs) unter Verwendung einer modifizierten Version von Marfeys Reagenzien wurde verwendet, um die aus den Proben extrahierten d-/l-Ala-Enantiomere zu trennen. Die Konzentrationen von unmarkiertem und isotopenmarkiertem Ala wurden mithilfe einer Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie gemessen, die an ein Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt war. Um schließlich erste Erkenntnisse über die möglichen biologischen Auswirkungen von d-Ala zu gewinnen, wurden Peptidprofile in Inseln und Hypophyse durch Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI)-Flugzeit-Massenspektrometrie (TOF) charakterisiert. Hier haben wir die Quellen von d-Ala bei Säugetieren bestätigt und die biologische Verteilung von d-Ala durch Darmabsorption aufgedeckt und damit den Weg für zukünftige Funktionsstudien dieses potenziellen Signalmoleküls in der Mikrobiom-Darm-Hirn-Achse geebnet.

Das experimentelle Schema zur Bestimmung der Bioverteilung und Racemisierung von l/d-Alanin. Zwei orale Verabreichungsszenarien, Sondenernährung und Trinkwasserergänzung, werden veranschaulicht, gefolgt von einer Tabelle, in der die für die Aminosäureanalyse entnommenen Proben beschrieben werden.

Messungen von endogenem, unmarkiertem freien d- und l-Ala wurden in den Tierproben sowie im Mäusefutter durchgeführt (Abb. 2). d-Ala-Prozentsätze (d-Ala/(l-Ala+d-Ala)%) für Tierproben (Abb. 2a) und Mäusefutter (Abb. 2b) wurden berechnet und zusammen mit den d-Ala-Konzentrationen aufgetragen (Abb. 2c–e). Um den d-Ala-Prozentsatz und den d-Ala-Gehalt in jedem Probentyp zu vergleichen, wurden paarweise Vergleiche einzeln zwischen keimfreien und herkömmlichen Mäusen durchgeführt. Wir fanden heraus, dass Plasma, Hypophyse, Speicheldrüse, Dünndarminhalt, Dickdarm und Dickdarminhalt bei herkömmlichen Mäusen im Vergleich zu keimfreien Mäusen einen höheren d-Ala-Prozentsatz aufwiesen. Allerdings stimmten die Trends der d-Ala-Konzentration in den Proben nicht immer mit dem d-Ala-Prozentsatz überein. Nur Azinusgewebe, Dickdarm und Darminhalt zeigten höhere d-Ala-Konzentrationen. Unter allen Proben zeigte der Dickdarminhalt von konventionellen Mäusen den höchsten d-Ala-Prozentsatz. Pankreasinseln und Azinusgewebe gehörten sowohl bei keimfreien als auch bei konventionellen Mäusen zu den höchsten der gemessenen Gewebetypen. Während Insel- und Azinusgewebe bei keimfreien und konventionellen Mäusen einen ähnlichen d-Ala-Prozentsatz aufwiesen, zeigten Azinusgewebe bei konventionellen Mäusen höhere d-Ala-Konzentrationen. Interessanterweise war die d-Ala-Konzentration bei herkömmlichen Mäusen deutlich höher als bei keimfreien Mäusen, während der d-Ala-Prozentsatz ähnlich war, was auf einen ähnlichen Trend von l-Ala im Azinusgewebe herkömmlicher Mäuse hinweist.

a d-Ala-Prozentsätze (d-Ala/(l-Ala+d-Ala)%) und (c–e) d-Ala-Konzentrationen werden in Proben von keimfreien (n = 8) und konventionellen Mäusen (n =) gezeigt 3) sowie die Prozentsätze im Mäusefutter (b) (n = 4). Sternchen kennzeichnen die paarweisen Vergleiche mit statistischer Signifikanz (α = 0,05) aus Mann-Whitney-Tests. Jeder Datenpunkt stellt eine Probe von einem einzelnen Tier dar; Für Mäusefutter stellen vier Datenpunkte vier Proben dar, die aus zwei Lebensmittelchargen entnommen wurden (1 und 3 Proben für jede Charge). Schwebende Balken zeigen Minimum und Maximum an, und die mittleren Linien zeigen den Median an. SI Dünndarm.

Es wurden zwei Szenarien für die orale Verabreichung von d-Ala-13C3,15N implementiert: eine einmalige Sondenernährung von ca. 40 mg mit einer Wartezeit von einer Stunde und eine zweiwöchige Fütterung von ca. 100 mg d-Ala-13C3,15N, geschätzt durch Wasser Verbrauch. Der d-Ala-13C3,15N-Gehalt in verschiedenen Proben wurde gemessen und berechnet. Blut aus den Geweben wurde bei der Gewebeentnahme mittels transkardialer Perfusion entfernt. Die Konzentrationen von d-Ala-13C3,15N im Plasma-/Gewebe-/Darminhalt wurden anhand der LC-MS/MS-Datenanalyse berechnet, wie im Abschnitt „Methode“ angegeben.

Wir fanden zunächst heraus, dass die Plasmakonzentration von d-Ala-13C3,15N in zwei oralen Verabreichungsszenarien drastisch unterschiedlich war (Abb. 3a, b). Um Vergleiche zwischen den beiden Verabreichungsmodellen zu ermöglichen, normalisierten wir daher die d-Ala-13C3,15N-Konzentration in Geweben/Darminhalten auf die d-Ala-13C3,15N-Konzentration im Plasma desselben Tieres (Gleichung 1 in Methode). ). Diese Normalisierungsstrategie wurde durch die visuelle Beobachtung und die Pearson-Korrelationsergebnisse gestützt, die überwiegend positive Korrelationen zwischen dem d-Ala-13C3,15N-Spiegel im Plasma und dem d-Ala-13C3,15N-Spiegel im Gewebe-/Darmgehalt zeigten, was darauf hindeutet, dass der d-Ala-13C3,15N-Spiegel im Plasma Der 13C3,15N-Spiegel kann verwendet werden, um das Dosierungsszenario darzustellen und biologische Variationen zu normalisieren (Ergänzende Abbildung 1, Ergänzende Tabelle 1). Es wurden paarweise Vergleiche der normalisierten d-Ala-13C3,15N-Konzentration zwischen Sonde und Fütterung desselben Probentyps durchgeführt (Abb. 3c – e). Die Ergebnisse zeigten, dass die normalisierten d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen in der Hypophyse und im Gehirn in der Fütterungsgruppe statistisch signifikant höher waren als in der Sondengruppe, während interessanterweise der Dünndarminhalt in der Gruppe niedrigere normalisierte d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen aufwies Fütterungsgruppe. Wir verglichen auch die relativen d-Ala-13C3,15N-Gehalte zwischen den Probentypen (Abb. 3f, g). Die Normalisierung der d-Ala-13C3,15N-Konzentration auf die unmarkierte Gesamt-Ala-Konzentration erzeugte eine einheitenlose Metrik für den relativen d-Ala-13C3,15N-Gehalt und ermöglichte probenübergreifende Vergleiche innerhalb desselben Verabreichungsszenarios (Gleichung 2). Ein gepaarter Friedman-Test wurde verwendet, um die Gewebe desselben Tieres in der Varianzanalyse (ANOVA) abzugleichen. ANOVA-Ergebnisse zeigten, dass der Probentyp einen statistisch signifikanten Einfluss auf den relativen d-Ala-13C3,15N-Gehalt sowohl in der Sonden- (p = 0,0002) als auch in der Fütterungsgruppe (p < 0,0001) hatte. In beiden Verabreichungsmodellen trugen Insel- und Azinusgewebe erheblich zu den beobachteten Varianzen bei und waren statistisch signifikant höher als bei mehreren anderen Probentypen. Die relativen d-Ala-13C3,15N-Gehalte in allen Probentypen im Sondenmodell sind etwa zwei Größenordnungen höher als im Fütterungsmodell, was mit der Beobachtung mit Plasma übereinstimmt (Abb. 3a, b). Wir haben auch eine andere Normalisierungsstrategie getestet, indem wir weiter auf den relativen d-Ala-13C3,15N-Spiegel im Plasma normalisierten (Gleichung 3) und ähnliche Ergebnisse gefunden (ergänzende Abbildung 2).

a, b Konzentrationen (pmol/μl) von d-Ala-13C3,15N, nachgewiesen im Plasma von Tieren, denen d-Ala-13C3,15N oral über eine Sonde oder Fütterung verabreicht wurde. c–e Normalisierte d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen (Gl. 1) in verschiedenen Probentypen. Sternchen geben die statistische Signifikanz der Mann-Whitney-Tests an. f, g Relativer d-Ala-13C3,15N-Gehalt (Gleichung 2) in verschiedenen Probentypen in (f) Sonden- und (g) Fütterungsexperimenten. Sternchen mit Klammern geben einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,05) zwischen Stichprobentypen aus dem Post-hoc-Mehrfachvergleich nach Dunn nach Friedmans gepaarter ANOVA an (**p < 0,01, *p < 0,05). Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Probe von einem einzelnen Tier (n = 4). Schwebende Balken zeigen Minimum und Maximum an, und die mittleren Linien zeigen den Median an. Speicheldrüsenergebnisse im Sondenexperiment werden in (b, c) nicht gezeigt und aufgrund der geringen Stichprobengröße (n = 2) nicht in die Statistik einbezogen. N/S: nicht angezeigt. SI: Dünndarm.

Die Wirkung der Verabreichung von l- und d-Ala auf keimfreie Mäuse wurde durch Kartierung der biologisch aktiven Peptidprofile in Hypophysen- und Pankreasinseln untersucht. Das Extraktionsverfahren für Aminosäuren extrahierte auch Peptide aus denselben Pankreasinseln und Hypophysenproben. Wir haben MALDI-TOF MS verwendet, da hierfür nur ein kleiner Teil der begrenzten verfügbaren Probenmenge erforderlich ist. Wir konnten mehrere bekannte biologisch aktive Peptide aus denselben Proben, die für die Aminosäureanalyse verwendet wurden, nachweisen und halbquantifizieren. Peptidlisten wurden erstellt, indem die erfassten Massenlisten mit der vorhergesagten Peptidmasse von UniProt und den Ergebnissen früherer Peptidomics-Studien der Pankreasinseln und Hypophysen abgeglichen wurden, einschließlich Daten aus unserer eigenen Gruppe32,33,34,35,36,37,38. Erkannte Peptide (Supplementary Data 1) werden bekannten Prohormonen zugeordnet, von denen berichtet wurde, dass sie in Inseln oder Hypophysen exprimiert werden, einschließlich Insulin 1, Chromogranin A, Insel-Amyloid-Polypeptid, Somatostatin, Glucagon, Provasopressin und Proopiomelanocortin. Noch wichtiger ist, dass wir mithilfe des Peptid-Massen-Fingerprint-Ansatzes mehrere Peptide desselben Prohormons beobachtet haben39,40, was die Sicherheit sowohl der Prohormonidentifizierung als auch der Peptidzuordnung erhöhte, wie in zahlreichen Studien38,41,42 gezeigt.

Die Vulkandiagramme in Abb. 4 zeigen die Unterschiede in den Peptidprofilen der Pankreasinseln und der Hypophyse nach der zweiwöchigen Zugabe von mit stabilem Isotop markiertem l- und d-Ala zum Trinkwasser. Die Grenzlinien für log2 (Fachänderung) wurden bei -1 und 1 gezeichnet und für p-Werte bei -log(0,05). Einzelne ungepaarte, zweiseitige t-Tests wurden verwendet, um die normalisierte Intensität der Peptidsignale in der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe zu vergleichen. Mögliche Fehlentdeckungen sollten im Auge behalten werden, da keine Multiplizität korrigiert wurde. Im Allgemeinen führten stabilisotopenmarkiertes l- und d-Ala zu unterschiedlichen Reaktionen bei den Peptidspiegeln. Nach der Behandlung mit d-Ala-13C3,15N zeigten die Inseln einen statistisch signifikant verringerten Spiegel des Insel-Amyloid-Polypeptids und einen erhöhten Spiegel des C-Peptids (Abb. 4a). In mit l-Ala behandelten Gruppen von Pankreasinseln wurden keine ähnlichen Veränderungen festgestellt (Abb. 4b). In der Hypophyse zeigte sich nach der Behandlung mit d-Ala-13C3,15N der Spiegel des phosphorylierten Corticotropin-ähnlichen Zwischenpeptids um mehr als das Zweifache, während das J-Peptid einen statistisch signifikanten Anstieg zeigte (Abb. 4c). Die Behandlung mit l-Ala-2,3,3,3-D4 führte zu stärkeren Veränderungen der Peptidspiegel in der Hypophyse, unterschied sich jedoch erheblich von den mit d-Ala-13C3,15N behandelten Gruppen (Abb. 4d).

a, b Pankreasinseln. c, d Hypophyse. Vulkandiagramme zeigten Ergebnisse unkorrigierter multipler t-Tests zwischen behandelten und Kontrollgruppen. Jeder Datenpunkt stellt die fache Änderung und die p-Werte der log2-transformierten, normalisierten Spitzenintensitäten in den Proben von behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrolle dar. Datenpunkte mit einer absoluten Faltungsänderung von mehr als dem Zweifachen und/oder p-Werten kleiner als 0,05 werden mit zugewiesenen Peptidnamen markiert und farblich gekennzeichnet (blau für Abnahme und rot für Zunahme in der behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrolle). CLIP: Corticotropin-ähnliches Zwischenpeptid. J-Peptid: Verbindungspeptid.

Die Alanin-Racemase-Aktivität kann durch Überwachung der Umwandlung von l-Ala-2,3,3,3-d4 in d-Ala-3,3,3-d3 nachgewiesen werden (Abb. 5a). Die d-Ala-3,3,3-d3-Spiegel in verschiedenen Proben, die von keimfreien Mäusen, konventionellen Mäusen und Bakterienkulturen nach Verabreichung von l-Ala-2,3,3,3-d4 gesammelt wurden, wurden anhand von Überwachungssignalen in bestimmt Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Kanäle für d-Ala-3,3,3-d3 und in Abb. 5 nach Berechnungen von Rohsignalen zu Endkonzentrationen dargestellt. In allen Tierproben beobachteten wir Hintergrundsignale in den MRM-Kanälen für d-Ala-3,3,3-d3 rund um die Retentionszeit von d-Ala (ergänzende Abbildung 3 als Beispiel), von denen wir glauben, dass sie biologischer Natur sind Matrizen und ergeben somit die Spurenwerte von d-Ala-3,3,3-d3, die in Kontrollproben gezeigt werden (graue Balken in Abb. 5). Paarweise Vergleiche zwischen Kontroll- und Behandlungsgruppen wurden mithilfe nichtparametrischer Mann-Whitney-Tests durchgeführt. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede in den d-Ala-3,3,3-d3-Spiegeln zwischen keimfreien Kontrolltieren und Mäusen gefunden, die 2 Wochen lang mit l-Ala-2,3,3,3-d4 gefüttert wurden, was auf keine Alanin-Racemase-Aktivitäten hinweist nachgewiesen bei keimfreien Mäusen, die zwei aufeinanderfolgende Wochen lang mit l-Ala-2,3,3,3-d4 gefüttert wurden.

a Illustration der Alanin-Racemase-Aktivität, die l-Ala-2,3,3,3-d4 in d-Ala-3,3,3-d3 umwandelt. b–e Konzentrationen von d-Ala-3,3,3-d3 in Proben von keimfreien Mäusen nach zweiwöchiger Fütterung mit l-Ala-2,3,3,3-d4 oder normalem Wasser als Kontrolle. g–j Konzentrationen von d-Ala-3,3,3-d3 in Proben von konventionellen Mäusen 1 Stunde nach Sondenernährung mit einer Lösung, die dasselbe stabile Isotop mit der Markierung l-Ala oder Kochsalzlösung wie die Kontrolle enthält. Paarweise Vergleiche unter Verwendung von Mann-Whitney-Tests (zweiseitig für keimfreie und einseitig für herkömmliche Mäuse) wurden zwischen der Kontroll- und der dosierten Gruppe individuell für jeden Probentyp durchgeführt. f Racemisierung von l-Ala-2,3,3,3-d4 in Bakterienkultur. Einseitige Mann-Whitney-Tests wurden verwendet, um den Zeitpunkt Null einzeln mit den beiden anderen Zeitpunkten zu vergleichen. Jeder Datenpunkt repräsentiert eine Probe von einem einzelnen Tier (n = 4 für keimfreie und n = 3 für konventionelle Mäuse) oder ein Röhrchen mit Bakterienbiomasse (n = 3). Sternchen mit Klammern geben die statistische Signifikanz an (U = 0, vollständige Trennung). Schwebende Balken zeigen Minimum und Maximum an, und die mittleren Linien zeigen den Median an. SI: Dünndarm.

Um die Alaninracemase-Aktivität in reinen E. coli-Kulturen zu untersuchen, wurde l-Ala-2,3,3,3-d4 in Kulturmedien gegeben und die d-Ala-3,3,3-d3-Konzentrationen in der Bakterienbiomasse bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass Alaninracemase-Aktivitäten in der E. coli-Biomasse nach ein- und fünfstündiger Inkubation zu einem zeitabhängigen Anstieg der d-Ala-Enantiomerspiegel führten (Abb. 5f). Obwohl keimfreie Mäuse keine nachweisbaren Alanin-Racemase-Aktivitäten zeigten, konnte die Umwandlung von l-Ala-2,3,3,3-d4 in d-Ala-3,3,3-d3 bei herkömmlichen Mäusen nur 1-3 Tage lang leicht nachgewiesen werden. h nach oraler Sondenernährung einer einzelnen hohen Dosis von l-Ala-2,3,3,3-d4 (Abb. 5g – j). Die Muster der relativen d-Ala-3,3,3-d3-Gehalte (Gl. 2) über die Probentypen hinweg ähnelten denen aus Sondenexperimenten mit d-Ala-13C3,15N (ergänzende Abbildung 4, Abbildung 3f). außer im Dickdarm und im Dickdarminhalt. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Sondenexperimenten mit keimfreien Mäusen waren die relativen d-Ala-3,3,3-d3-Spiegel im Dickdarm und Dickdarminhalt hoch, was auf mikrobielle Racemaseaktivitäten im Dickdarminhalt hinweist.

Unter Verwendung keimfreier Mäuse und stabil isotopenmarkiertem Alanin zur oralen Verabreichung lassen unsere Ergebnisse mehrere wichtige Schlussfolgerungen zu. Erstens stammt das freie d-Ala bei Mäusen sowohl aus der Nahrung als auch aus der Mikrobiota, jedoch nicht aus der endogenen Synthese. Keimfreie Mäuse weisen nachweisbare Mengen an freiem d-Ala auf, was darauf hindeutet, dass es d-Ala-Quellen gibt, die nicht mit der Mikrobiota in Zusammenhang stehen (Abb. 2a). Da das Mäusefutter einen hohen d-Ala-Anteil hat, kann die Nahrung eine Quelle für freies d-Ala sein (Abb. 2b). Viele Studien haben gezeigt, dass sowohl rohe als auch verarbeitete Lebensmittel unterschiedliche Mengen an freien d-AAs, einschließlich d-Ala43, enthalten. Der Vergleich zwischen keimfreien und herkömmlichen Mäusen zeigt deutlich, dass das Vorhandensein von Mikrobiota die d-Ala-Spiegel im Dickdarminhalt und im Dickdarmgewebe drastisch erhöht, was darauf hindeutet, dass aus Mikrobiota stammendes d-Ala über den Dickdarm absorbiert werden kann (Abb. 2a, c, e). ). Der höhere d-Ala-Gehalt im Dickdarminhalt im Vergleich zum Dünndarminhalt kann auf eine höhere Mikrobiomdichte im Dickdarminhalt zurückzuführen sein44. Der d-Ala-Prozentsatz im Plasma, in der Hypophyse, in den Speicheldrüsen und im Dünndarminhalt ist bei herkömmlichen Mäusen höher als bei keimfreien Mäusen, obwohl die Unterschiede bei der Betrachtung der d-Ala-Konzentrationen weniger offensichtlich sind oder verschwinden (Abb. 2a). , C). Bei Plasma, Hypophyse und Bauchspeicheldrüse konnten wir keine drastischen Unterschiede zwischen keimfreien und spezifisch pathogenfreien Mäusen feststellen, wie von Karawaka et al.18 berichtet. Gründe dafür können unter anderem unterschiedliche Tierstämme, gewähltes Futter, Messtechniken der d-Ala-Analyse, Probentyp (z. B. gesamte Bauchspeicheldrüse vs. isolierte Azinusgewebe), Ausmaß der Blutentnahme bei der Probenvorbereitung usw. sein. Zum Beispiel Bruckner et al. ermittelten den Anteil von d-Ala im Rattenfutter auf bis zu 6,9 %45, und wir maßen 12,6 % im Mäusefutter, das in unserer Studie verwendet wurde. Interessanterweise scheinen die in dieser Studie gemessenen d-Ala-Werte mit Ausnahme des Dickdarminhalts zu den niedrigsten gemeldeten Werten zu gehören (Ergänzungstabelle 2).

Unsere Ergebnisse zeigten, dass es bei keimfreien Mäusen keine nachweisbare Alanin-Racemase-Aktivität gab. Alanin-Racemasen, die l-Ala in seine d-Form umwandeln, wurden in vielen Mikroben und mehreren wirbellosen Wassertieren gefunden, bei Wirbeltieren wurde jedoch keine Alanin-Racemase charakterisiert8,24. Das Multisequenz-Alignment der Maus-Serin-Racemase und mehrerer selektiver Aminosäure-Racemasen von Prokaryoten, Hefen und Wirbellosen zeigte mehr Ähnlichkeiten der Maus-Serin-Racemase mit Aminosäure-Racemasen mit breiter Spezifität im Vergleich zu Alanin-Racemasen (ergänzende Abbildung 5). Bisher wurden Hinweise auf eine endogene Alaninracemase-Aktivität bei Wirbeltieren mit Speichel und Speicheldrüsen in Verbindung gebracht. Es wurde berichtet, dass mehr als 30 % des gesamten Ala im menschlichen Speichel in d-Form vorliegen30,46. Dieselben Studien zeigten jedoch, dass der d-Ala-Prozentsatz in Mundgewebezellen und in den Speicheldrüsen niedriger war, während Mikroorganismen in der Mundhöhle einen höheren d-Ala-Prozentsatz aufwiesen. Auch in den Speicheldrüsen von Ratten wurden niedrige d-Ala-Werte beobachtet (0,2–0,3 %31). Diese legen nahe, dass d-Ala, das aus dem oralen Mikrobiom stammt, wahrscheinlich zum im Speichel nachgewiesenen d-Ala beiträgt. Dennoch kann die Hypothese einer endogenen d-Ala-Synthese nicht ausgeschlossen werden. Unsere Ergebnisse zeigten deutlich, dass nach einer zweiwöchigen oralen Verabreichung von l-Ala-2,3,3,3-d4 keine Transformation von l- zu d-Ala beobachtet wurde (Abb. 5b – e). Um den Einfluss enantiomerer Verunreinigungen in den Standards auszuschließen, wurde der Gehalt an d-Ala-3,3,3-d3 in der zur oralen Verabreichung verwendeten l-Ala-2,3,3,3-d4-Lösung als vernachlässigbar bestimmt ( ~0,1 % nach dem Autoklavieren) (Ergänzungstabelle 3). Wir kommen zu dem Schluss, dass in keimfreien Mäusen innerhalb des von uns bewerteten Zeitrahmens und der von uns bewerteten Behandlungsdosis keine endogenen Alanin-Racemase-Aktivitäten vorhanden sind. Da Mikroben l-Ala-2,3,3,3-d4 schnell in seine d-Form umwandeln können (Abb. 5f), war es nicht überraschend, dass ein kurzes Sondenexperiment mit l-Ala-2,3,3,3 durchgeführt wurde -d4, durchgeführt mit herkömmlichen Mäusen mit normaler Mikrobiota, führte zum Nachweis der Alaninracemase-Aktivität in allen untersuchten Probentypen (Abb. 5g – j). Tatsächlich zeigte der Vergleich des normalisierten d-Isotopenverhältnisses mit unmarkiertem Ala über verschiedene Probentypen hinweg sehr ähnliche Muster wie im Sondenexperiment mit d-Ala-13C3,15N (ergänzende Abbildung 4; Abbildung 3f), mit Ausnahme der Dickdarm und Dickdarminhalt, wo d-Ala durch mikrobielle Alanin-Racemase-Aktivitäten produziert wurde. Unsere Ergebnisse stützen nachdrücklich die Schlussfolgerung, dass d-Ala in Mäusen aus der Mikrobiota und der Nahrung stammt und nicht durch endogene Biosynthese durch enzymatische Racemisierung.

Wir haben gezeigt, dass d-Ala vom Darm absorbiert werden kann, und die Bioverteilung von im Darm absorbiertem d-Ala durch orale Verabreichung von d-Ala-13C3,15N an keimfreien Mäusen ohne Beeinträchtigung durch Mikrobiota gezeigt. Die orale Verabreichung von d-Ala an Nagetiere wurde durchgeführt47,48,49,50 und zeigte erhöhte d-Ala-Spiegel im Serum, Urin und einigen Teilen des Gehirns, jedoch nicht in der Hypophyse. Die Alaninracemase-Aktivität der Darmmikrobiota könnte jedoch eine genaue Bewertung der im Darm absorbierten d-Ala-Bioverteilung behindert haben. Bei keimfreien Mäusen und d-Ala-13C3,15N unterschieden wir das exogene d-Ala durch orale Verabreichung und das unmarkierte d-Ala aus der Nahrung und schlossen den Beitrag mikrobieller Aktivitäten aus. Die beiden Fütterungsszenarien führten zu einem etwa 400-fachen Unterschied im d-Ala-13C3,15N-Spiegel im Plasma, obwohl der Gesamtverbrauch an d-Ala-13C3,15N im Kurzzeitexperiment geringer war (~40 vs 100 mg) (Abb. 3a, b). Unter der Annahme einer ähnlichen d-Ala-Absorptionseffizienz durch den Darm deutete dies darauf hin, dass der Großteil des oral verabreichten d-Ala-13C3,15N wahrscheinlich im Laufe der Zeit aus dem Tier entfernt wurde. Wir haben auch festgestellt, dass Blut das im Darm absorbierte d-Ala-13C3,15N zu den Geweben transportiert. In beiden Fütterungsszenarien war das Verhältnis von d-Ala-13C3,15N zum gesamten unmarkierten Alanin im Plasma in allen Proben mit Ausnahme von Insel- und Azinusgeweben immer eines der höchsten (ergänzende Abbildung 1) und korrelierte überwiegend positiv mit dem Verhältnis in anderen Proben (Ergänzungstabelle 1).

Wir erhielten eindeutige Hinweise darauf, dass über den Darm absorbiertes d-Ala in das Zentralnervensystem gelangt und sich im Laufe der Zeit ansammelt. Die Normalisierung der d-Ala-13C3,15N-Konzentration (Gleichungen 1–3) ermöglichte Vergleiche zwischen Fütterungsszenarien und verschiedenen Probentypen. In der Hypophyse (6-fach) und im Gehirn (42-fach) der Ernährungsgruppe, die dem Isotop zwei Wochen lang ausgesetzt war, wurden deutlich höhere d-Ala-13C3,15N-Werte gefunden als in der Gruppe, die eine Stunde lang mit der Sonde exponiert wurde (Abb. 3d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich d-Ala-13C3,15N im Laufe der Zeit in der Hypophyse und im Gehirn ansammelte. Die Anreicherung von d-Ala-13C3,15N im Gehirn zeigt auch, dass d-Ala die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann. Da d-Ala ein Co-Agonist des NMDAR ist und nachweislich unterschiedliche Konzentrationen in verschiedenen Teilen des Gehirns aufweist, lässt die über den Darm absorbierte Anreicherung von d-Ala im Gehirn im Laufe der Zeit auf einen Mechanismus zur Regulierung der d-Ala-Spiegel schließen, was möglicherweise der Fall ist im Zusammenhang mit seinen Funktionen. Beispielsweise wurde über die Korrelation der d-Ala-Spiegel bei Nagetieren und Menschen mit dem zirkadianen Rhythmus berichtet16,17,18,19, während die d-Ala-Konzentration Berichten zufolge in der Zirbeldrüse hoch ist49. Da sowohl d-Ala als auch d-Ser mit derselben NMDA-Rezeptorbindungsstelle interagieren, wird es interessant sein zu bestimmen, wie diese beiden Systeme interagieren, vorausgesetzt, eines ist endogen und das andere ein exogenes Molekül.

Frühere Erkenntnisse, einschließlich Immunfärbung gegen d-Ala20,21 und Nachweis einer d-Ala-Änderung bei Glukosestimulation22, haben auf die Möglichkeit hingewiesen, dass d-Ala an der Regulierung des Glukosestoffwechsels und der Hypophysenfunktionen beteiligt ist. Interessanterweise scheinen die zirkadianen Veränderungen des d-Ala-Spiegels auch mit den Fütterungsparametern und dem Insulinspiegel16 sowie der unterschiedlichen Darmabsorption von d-Ala18 zu korrelieren. Wir fanden heraus, dass sowohl bei kurz- als auch bei langfristiger oraler Verabreichung von d-Ala-13C3,15N das normalisierte d-Ala-13C3,15N-Verhältnis sowohl in den Pankreasinseln als auch im Azinusgewebe immer ähnlich war und zu den höchsten gemessenen gehörte (Abb . 3f, g), obwohl die normalisierte d-Ala-13C3,15N-Konzentration in den Pankreasinseln viel niedriger war als die im Azinusgewebe (Abb. 3c). Die Insel- und Azinusgewebe unbehandelter Tiere zeigten sowohl bei keimfreien als auch bei konventionellen Mäusen ebenfalls hohe d-Ala-Werte (Abb. 2a). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Inseln und das Azinusgewebe im Darm absorbiertes d-Ala schnell aufnehmen und über die Zeit einen relativ stabilen d-Ala-Spiegel aufrechterhalten können.

Angesichts des hohen d-Ala-Gehalts in endokrinen Strukturen wie Inseln und Hypophyse fragen wir, ob die Verabreichung von d-Ala die Peptidhormone beeinflusst. Frühere Forschungsarbeiten belegen den Einfluss der D-Aminosäure- und Peptiddynamik auf die Hypophyse und die Pankreasinseln. Beispielsweise wurde festgestellt, dass D-Aspartat die Freisetzung von Prolaktin, Wachstumshormon und luteinisierendem Hormon aus dem Hypophysenvorderlappen der Ratte induziert51,52. Daher haben wir vorläufige Messungen zu den Auswirkungen von d-Ala auf die Hypophyse und die Pankreasinseln durchgeführt, die von denselben Tieren/Proben gesammelt wurden, denen d-Ala-13C3,15N oder l-Ala-2,3,3,3-d4 für 2 verabreicht wurde Wochen (Abb. 4). Unkorrigierte, ungepaarte, mehrfache t-Tests wurden verwendet, um die Anzahl der molekularen Merkmale zu maximieren, die die Peptidprofile unterscheiden. Die Ergebnisse zeigten, dass die zweiwöchige Behandlung mit d-Ala- oder l-Ala-Isotopen zu Unterschieden in den Peptidprofilen sowohl der Pankreasinseln als auch der Hypophyse führte. Es wurde festgestellt, dass sich die Spiegel mehrerer Peptide nur in den mit d-Ala behandelten Gruppen, nicht aber in den mit l-Ala behandelten Gruppen veränderten. In den meisten Fällen zeigte nur ein Peptid in den behandelten Gruppen eine merkliche Veränderung seiner Spiegel, während andere Peptide desselben Prohormons gleich blieben. Beispielsweise zeigten von den nachgewiesenen Peptiden des Proopiomelanocortin-Prohormons nur phosphorylierte Corticotropin-ähnliche Zwischenpeptide, von denen bekannt ist, dass sie als Insulinsekretagogum in der Bauchspeicheldrüse wirken53 und Verbindungspeptide mit unbekannten biologischen Rollen, auffällige Veränderungen in ihren Spiegeln. Interessanter ist, dass die Änderungsrichtungen bei diesen beiden Peptiden entgegengesetzt waren (Abb. 4c). Die biologische Bedeutung dieser Beobachtungen erfordert weitere Untersuchungen mit einer quantitativeren Methode für ein umfassenderes Verständnis des Einflusses von d-Ala auf die Peptiddynamik.

Funktionell sind sowohl d-Ser als auch d-Ala wirksame Co-Agonisten des NMDA-Rezeptors. Während d-Ser ein bekannter endogener Neuromodulator ist, haben wir hier gezeigt, dass d-Ala nicht lokal synthetisiert wird, sondern aus dem Darmmikrobiom und der Nahrung stammt, indem wir die Ansammlung und Umwandlung von stabil isotopenmarkiertem d-/l-Ala nach oraler Verabreichung im Keim gemessen haben -freie und konventionelle Mäuse. Wir fanden heraus, dass das Insel- und Azinusgewebe der Bauchspeicheldrüse die höchsten Mengen an im Darm absorbierten d-Ala-Isotopen aufwies und dass Hypophysen- und Gehirngewebe im Laufe der Zeit im Darm absorbiertes d-Ala anreicherten. Die Profilierung der Peptidspiegelveränderung in der Hypophyse und den Hypophyseninseln zeigte die mögliche Beteiligung von im Darm absorbiertem L- und D-Ala an den Funktionen des Nerven- und Hormonsystems. Wir kommen zu dem Schluss, dass Mikrobiota und Ernährung zwei Quellen für d-Ala bei Mäusen sind, während im Zeitraum unseres Versuchsdesigns keine endogene Synthese von d-Ala durch endogene Racemisierung beobachtet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die NMDA-Rezeptoraktivität von einem Gleichgewicht zwischen endogen synthetisiertem d-Ser und exogenem d-Ala aus der Nahrung/Darmmikrobiom abhängt, was ein einzigartiges metabolisches Zusammenspiel zwischen der Mikrobiota, der Ernährung sowie dem zu kontrollierenden Nerven- und Hormonsystem ermöglichen kann NMDA-Rezeptoraktivität.

In der Zwischenzeit skizzieren mehrere Einschränkungen in dieser Studie Fragen, die in weiteren Studien behandelt werden müssen. Die Verwendung keimfreier Mäuse stellt das Verständnis der Rolle von d-Ala unter normalen physiologischen Bedingungen vor Herausforderungen, da keimfreie Mäuse im Vergleich zu konventionell aufgezogenen Tieren biochemische und physiologische Anomalien aufweisen. Für ein umfassenderes Verständnis des Einflusses von d-Ala auf die Peptiddynamik ist eine bessere Quantifizierung von Neuropeptiden und Hormonen erforderlich. Außerdem sind weitere Einzelheiten zu d-Ala-Transportern erforderlich, um zu verstehen, wie d-Ala von verschiedenen Nerven- und Hormonsystemen aufgenommen wird. Aufgrund der Kosten für stabile Isotopenmarkierungen und keimfreie Tiere wurden eine begrenzte Anzahl an Tieren und nur zwei Zeitpunkte verwendet; Eine Zeitverlaufsstudie wird jedoch weitere Einblicke in die Pharmakokinetik von im Darm absorbiertem d-Ala liefern können. Schließlich sind mit der Entdeckung der d-Ala-Akkumulation im Gehirn weitere Studien erforderlich, um die Verteilung von im Darm absorbiertem d-Ala in verschiedenen Gehirnregionen zu untersuchen.

Die Isotope d-Ala-13C3,15N (Kat.-Nr.: 760277) und d-Ala-3,3,3-d3 (Kat.-Nr.: 642975) wurden von Sigma Aldrich bezogen. l-Ala-3,3,3-d3 (Kat.-Nr.: DLM-248-1) und l-Ala-2,3,3,3-d4 (Kat.-Nr.: DLM-250-PK), l- Die Isotope Leu-5,5,5-d3 (Kat.-Nr.: DLM-1259) und l-Ser-13C,15N (Kat.-Nr.: CNLM-7814) wurden von Cambridge Isotope Laboratories bezogen. Unbeschriftetes l-Ala wurde von Fluka gekauft und d-Ala stammte von Sigma Aldrich. Ein Satz wiederverwendbarer Edelstahl-Ernährungsnadeln (N-PK) mit 20 G 1,5 Zoll wurde von Braintree Scientific, Inc. erworben. Methanol (Kat.-Nr.: A456) und H2O (Kat.-Nr.: W64), Optima™ LC/MS-Qualität, waren gekauft von Fisher Scientific.

Tierversuche wurden gemäß dem Tierverwendungsprotokoll Nr. 19251 durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC) genehmigt wurde. Keimfreie männliche C57BL/6-Mäuse (9–11 Wochen alt) wurden von der Rodent Gnotobiotic Facility am UIUC erhalten. Herkömmliche männliche C57BL/6-Inzuchtmäuse (8 Wochen alt) wurden von Envigo gekauft und in der Tierhaltung am Beckman Institute der UIUC gehalten. Alle Mäuse wurden als 2 Tiere pro Käfig gehalten. Sowohl keimfreie als auch konventionelle Mäuse wurden mit sterilisiertem 2019S Teklad Global 19 % Protein Extruded Rodent Diet (sterilisierbar) von Envigo gefüttert. Da Männchen und Weibchen aufgrund ihrer unterschiedlichen Hormonprofile und Zyklen getrennt untersucht werden müssen, haben wir uns entschieden, diese Studie nur mit männlichen Mäusen durchzuführen.

Aufgrund des hohen Preises der von uns verwendeten keimfreien Mäuse und stabilen Isotope haben wir uns entschieden, die minimal akzeptable Stichprobengröße für die Statistik zu verwenden (n = 3 oder 4 für jede Gruppe) und zu untersuchen, ob bei einer kleinen Stichprobengröße Auswirkungen zu beobachten sind. Mäusekäfige wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um eine Kontrolle oder orale Verabreichung stabiler Isotope durchzuführen. Jedes Experiment zur oralen Verabreichung bestand aus einer gleichen Anzahl von Kontroll- und behandelten Tieren (n = 2 für keimfreie Mäuse, n = 3 für konventionelle Mäuse). Das Experiment zur oralen Verabreichung an keimfreie Mäuse wurde zweimal an verschiedenen Tagen durchgeführt und die Ergebnisse wurden zusammengefasst, um eine Gesamtprobengröße von 4 zu erhalten.

Lösungen von 0,9 % NaCl und 150 mg/ml d-Ala-13C3,15N wurden hergestellt und mit einem 0,22 μm PVDF-Sterilfilter filtriert. Mit geeigneten sterilen Verfahren wurden versiegelte, belüftete Überdruckkäfige mit 10 Wochen alten, keimfreien C57BL/6-Mäusen sowie Lösungen und Werkzeugen in eine Biosicherheitswerkbank überführt. Alle Materialien wurden zuvor autoklaviert/sterilfiltriert und unmittelbar vor dem Versand an das BSC über ein speziell entwickeltes Portal desinfiziert. Jede keimfreie Maus wurde im Biosicherheitsschrank gewogen und im Biosicherheitsschrank oral mit 260–270 μl (10 ml/kg Körpermasse) Kochsalzlösung oder d-Ala-13C3,15N-Lösung (1,5 g/kg Körpermasse) behandelt Schrank, zurück in seinen ursprünglichen Käfig gebracht und zurück zum Rack geschickt. Um den Einfluss des zirkadianen Rhythmus auf den Alaninspiegel bei Mäusen zu minimieren, wurden Sondenexperimente jeden Tag etwa zur gleichen Zeit (ca. 11 Uhr) durchgeführt. Nach 60 Minuten wurden die Mäuse zur CO2-Euthanasie und Sektion geschickt. Jedes Sondenexperiment umfasste 4 Mäuse (2 für Kochsalzlösung und 2 für d-Ala-13C3,15N). Der Versuch wurde zweimal wiederholt. Bei herkömmlichen Tieren, die mit l-Ala-2,3,3,3-d4 behandelt wurden, wurden die Tiere zwei Wochen lang nach ihrer Ankunft in unserer Einrichtung vor den Experimenten mit dem gleichen Futter wie keimfreie Mäuse sowie mit Lösungen von 0,9 % NaCl gefüttert 150 mg/ml l-Ala-2,3,3,3-d4 wurden oral mit 10 ml/kg Körpermasse Kochsalzlösung oder l-Ala-2,3,3,3-d4 (1,5 g/kg Körper) verabreicht Masse). Das Sondenexperiment umfasste 6 Mäuse (3 für Kochsalzlösung und 3 für l-Ala-2,3,3,3-d4) und folgte demselben Zeitplan wie die keimfreien Experimente.

Lösungen von 1,25 g/L d-Ala-13C3,15N und l-Ala-2,3,3,3-d4 wurden unter Verwendung des gleichen Leitungswassers, das zur Fütterung keimfreier Mäuse verwendet wurde, hergestellt, autoklaviert und mit geeignetem Wasser in den BSC geschickt sterilen Verfahren und zum Befüllen von Wasserflaschen in Mäusekäfigen verwendet. Im BSC wurden Wasserflaschen mit sterilem Leitungswasser, mit d-Ala-13C3,15N angereichertem Leitungswasser oder mit l-Ala-2,3,3,3-d4 angereichertem Leitungswasser in Käfige eingebaut, die bereits 9– 10 Wochen alte Mäuse und die Käfige wurden wieder in das Gestell gestellt. Während der zweiwöchigen Behandlung wurde der Wasserstand im Mäusekäfig jeden zweiten Tag per Augenschein überwacht und bei Bedarf nachgefüllt. Jedes Fütterungsexperiment umfasste 6 Mäuse (2 für jede Bedingung) und das Experiment wurde zweimal wiederholt.

Nach Ablauf der Behandlungszeit wurden die Tiere gegen Mittag in einen sauberen Behandlungsraum oder einen Autopsieraum transportiert, durch CO2-Erstickung eingeschläfert und anschließend in den Nachmittagsstunden Gewebe entnommen. Das Blut wurde mit einer 1-ml-Einwegspritze direkt aus dem aufgeschnittenen Herzen entnommen, in ein BD-Microtainer-Röhrchen (Kat.-Nr. 365965) überführt und auf Eis abgesetzt. Das Plasma wurde durch Zentrifugation des BD Microtainer-Röhrchens (Lithiumheparin) bei 3000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur abgetrennt. Anschließend wurden die Tiere mit kaltmodifizierter ausgewogener Gey-Salzlösung (mGBSS, 1,5 mM CaCl2, 4,9 mM KCl, 0,2 mM KH2PO4, 11 mM MgCl2, 0,3 mM MgSO4, 138 mM NaCl, 27,7 mM NaHCO3, 0,8 mM Na2HPO4, 25 mM HEPES) perfundiert. pH 7,2) durch das Herz. Die Bauchspeicheldrüse der Maus wurde mit einer kleinen Menge kalter Verdauungslösung durchströmt (Einzelheiten siehe unten) und zur Isolierung von Inseln und Azinusgewebe gesammelt. Der Magen-Darm-Trakt, einschließlich des Dünndarms und des Dickdarms, wurde der Länge nach aufgeschnitten, um den Inhalt des Dünndarms und des Dickdarms zu sammeln, und die Gewebe des Gastrointestinaltrakts wurden vor der Entnahme mehrmals in eiskaltem PBS-Puffer gespült. Gehirn, Speicheldrüsen und Hypophyse wurden ebenfalls entnommen. Alle Gewebe und Darminhalte sowie das abgetrennte Plasma wurden unmittelbar nach der Entnahme auf Trockeneis gelegt und bis zu den nächsten Schritten bei -80 °C gelagert.

1,06 Wünsch-Einheiten Liberase TL (Sigma) und 0,1 mg/ml rekombinante DNase I (Desoxyribonuklease), zubereitet in Hanks ausgewogener Pufferlösung (HBSS, GIBCO) mit 5 mM Calciumchlorid und 25 mM HEPES (Sigma) und bis zur Verwendung auf Eis ruhen lassen . 2 ml dieser Enzymlösung wurden durch den Hauptgallengang in die Bauchspeicheldrüse der Maus perfundiert. Die perfundierten Pankreas wurden aus dem Körper entfernt und in konischen Röhrchen mit 5 ml kalter Liberase-Lösung auf dem Eis platziert. Die Röhrchen wurden zum Aufschluss 10 Minuten lang in das vorgewärmte Wasserbad bei 37 °C gestellt. Am Ende der Inkubation wurde kaltes HBSS mit 0,2 % Rinderserumalbumin in Röhrchen gegeben und die Röhrchen wurden kräftig geschüttelt, um sicherzustellen, dass die Inseln vollständig vom Gewebe getrennt waren. Nach 3-minütiger Zentrifugation bei 300 g wurde der Überstand entfernt. Diese Schritte wurden dreimal wiederholt. Im letzten Schritt wurde der Überstand durch Dekantieren abgegossen und im Röhrchen verbliebene Puffer wurden mechanisch entfernt. Anschließend wurden Pellets des verdauten Gewebes unter leichtem Schütteln in 7 ml steriler Histopaque 1077-Lösung (Sigma) resuspendiert. 3 ml kalter HBSS-Puffer wurden auf die Gewebesuspension geschichtet und die Röhrchen wurden 15 Minuten lang bei 900 g zentrifugiert. Die in den Überständen befindlichen Inseln wurden durch ein 70 μm steriles Zellsieb filtriert und dreimal mit kaltem HBSS gewaschen, um Zelltrümmer zu entfernen. Die gereinigten Inseln wurden in eine mit kaltem HBSS gefüllte Petrischale gelegt, schnell manuell entnommen und zur Analytextraktion in das kalte angesäuerte MeOH überführt (MeOH:H2O:Essigsäure 90:9:1 nach Volumen).

Der Escherichia coli (E. coli)-Stamm OP50 wurde auf Luria-Bertani-Agarplatten gezüchtet, und einzelne Kolonien wurden gepflückt und in eine Flasche mit 100 ml flüssiger Luria-Bertani-Brühe für das Wachstum über Nacht geimpft. Am nächsten Tag wurden Aliquote von 5 ml der E. coli-Flüssigkultur über Nacht in sterile Kulturröhrchen überführt und 1 ml einer 1,25 g/L sterilen l-Ala-2,3,3,3-d4-Lösung oder autoklaviertes Wasser hinzugefügt hinzugefügt. Aliquots von 1 ml Bakterienflüssigkultur wurden vor der Isotopenzugabe und 1 und 5 Stunden nach der Isotopenzugabe gesammelt. Die Biomasse wurde durch 1-minütige Zentrifugation bei 16.000 g gesammelt, der Überstand mit einer 1-ml-Pipettenspitze entfernt, erneut zentrifugiert, der verbleibende Überstand mit einer 200-μl-Pipettenspitze entfernt, zentrifugiert und der gebildete Überstand mit einer 10-μl-Pipettenspitze entfernt . Die resultierende pelletierte Biomasse wurde gewogen und bis zur Aminosäureextraktion bei –80 °C eingefroren.

Gefrorene Proben des Gehirns, der Speicheldrüse, des Dünndarms, des Dickdarms oder des Mäusefutters wurden entweder mit einem Metallgewebezerkleinerer oder einem Metallhammer auf einer flachen Metalloberfläche zerkleinert, und alle Metallteile wurden durchgehend auf Trockeneis kalt gehalten. Zerkleinerte kalte Probenflocken wurden dann schnell in ein 2-ml-Gewebehomogenisierungs-CKMix-Röhrchen überführt. Nach dem Wiegen wurden 600 μl eiskaltes 1:1 MeOH:H2O zur Gewebehomogenisierung unter Verwendung eines Precellys® Evolution Gewebehomogenisators mit Kühlfalle (Bertin Corp.) hinzugefügt. Die Proben wurden bei 2 × 30 s mit einer 30 s langen Pause zweimal bei 7200 U/min homogenisiert, und die resultierenden Suspensionen wurden überführt und 20 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein anderes Röhrchen überführt und mit einem Genevac™ miVac Zentrifugalkonzentrator getrocknet. Das verbleibende Pellet wurde mit 600 μl eiskaltem Wasser versetzt, gefolgt von Vortexen, Ultraschallbehandlung und Zentrifugation bei 12.000 g für 20 Minuten bei 4 °C. Der wässrige Überstand wurde gesammelt, in das getrocknete Röhrchen gegeben, das zuvor zum Sammeln des Methanolüberstands verwendet wurde, und unter Verwendung des Vakuumkonzentrators getrocknet. Die resultierenden Proben wurden bis zu den nächsten Schritten bei –20 °C gelagert.

Gefrorene Proben wurden aufgetaut und mit Einwegspateln wurde ein Teil der Probe geschöpft und in ein gewebehomogenisierendes CKMix-Röhrchen überführt. Es wurden die gleichen Probenverarbeitungs- und Analytextraktionsschritte wie für Gehirn-/Speicheldrüsen-/Darmproben befolgt.

Gefrorene Plasmaproben wurden aufgetaut und 40 μl Plasma in ein neues Röhrchen überführt. 600 μl 1:1 MeOH:H2O und 600 μl H2O wurden nacheinander zugegeben, um Plasmaproben zu extrahieren. Die resultierenden Überstände wurden nach dem gleichen Verfahren wie oben kombiniert, getrocknet und gelagert.

Zur Extraktion von Aminosäuren und Peptiden aus Hypophysenproben wurde ein Verfahren verwendet, das kochendes Wasser, angesäuertes MeOH und eine 0,25 %ige Essigsäurelösung umfasste. Zu den gefrorenen Hypophysenproben wurden 400 μl auf 90 °C vorgewärmtes Wasser gegeben, gefolgt von einer 10-minütigen Inkubation in einem kochenden Wasserbad. Die Proben wurden sofort auf Eis abgekühlt. Zum Aufschließen und Homogenisieren der Proben wurde ein Handhomogenisator mit Einweg-Kunststoffstößel verwendet, gefolgt von einer 15-minütigen Zentrifugation bei 12.000 g und 4 °C. Die Überstände wurden gesammelt, in Sammelröhrchen mit geringer Proteinbindung (Thermo Fisher) überführt und mit dem Genevac-Konzentrator zur Trockne eingedampft. Das gleiche Extraktionsverfahren wurde mit 400 μl angesäuertem MeOH und 400 μl 0,25 %iger Essigsäure wiederholt, mit der Ausnahme, dass Badbeschallung anstelle eines Handhomogenisators verwendet wurde. Getrocknete Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20 ° C gelagert.

In 400 μl angesäuertem MeOH gelagerte Insel- und Azinusgewebe wurden mit einem Handhomogenisator auf Basis eines Einweg-Kunststoffstößels homogenisiert und anschließend 15 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert. Die Überstände wurden in ein neues Röhrchen mit geringer Proteinbindung überführt. Die verbleibenden Pellets wurden mittels Badbeschallung mit 400 μl MeOH und 400 μl Wasser extrahiert. Alle drei Überstände wurden vereinigt, gemischt, aliquotiert und zur Trockne eingedampft. Getrocknete Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert.

Extrakte aus Gehirn, Speicheldrüsen, Eingeweiden, Darminhalt, Plasma und Mäusefutterproben wurden mithilfe von Zentrifugalfiltern weiterverarbeitet. l-Leu-5,5,5-d3 wurde als interner Standard verwendet, um die Rückgewinnungsausbeute bei der Zentrifugenfiltration zu ermitteln. Getrocknete Extrakte wurden in 300 μl einer 33–100 μM l-Leu-5,5,5-d3-Lösung in Wasser rekonstituiert, gefolgt von Vortexen, Ultraschallbehandlung und Zentrifugation bei 16.000 g für 15 Minuten bei 4 °C. Die Überstände wurden dann mit einem 0,45-µm-Nanosep-MF-Zentrifugalgerät mit Bio-Inert®-Membran bei 10.000 g für 15 Minuten bei 4 °C filtriert, gefolgt von der Filtration mit einem 3-K-Nanosep®-Zentrifugalgerät mit Omega™-Membran bei 10.000 g für 65–75 Minuten min. bei 4 °C. Anschließend wurden die Filtrate mit einem Eppendorf Vacufuge-Konzentrator getrocknet und bis zu den nächsten Schritten bei –20 °C gelagert.

Gefrorene Bakterienbiomasse wurde aufgetaut und jeder Probe wurden 300 μl MeOH zugesetzt. Die Biomasse wurde durch wiederholtes Pipettieren in MeOH dispergiert, gefolgt von einer Badbeschallung für 10 Minuten oder bis sie sichtbar vollständig dispergiert war. Die resultierende Suspension wurde 2 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Die verbleibenden Pellets wurden weiter mit 300 μl Wasser extrahiert und der Überstand gesammelt. Überstände aus zwei Analytextraktionsrunden für dieselbe Probe wurden kombiniert und mit einem Eppendorf Vacufuge-Konzentrator getrocknet und bis zu den nächsten Schritten bei –20 °C gelagert.

Hypophysen-, Insel- und Azinusgewebeproben wurden in 40 μl 0,1 %iger Trifluoressigsäurelösung in Wasser rekonstituiert. Rekonstituierte Proben wurden 15 Minuten lang bei 4 °C und 12–14.000 g zentrifugiert. 0,5 μl Überstände wurden mit gleichen Volumina einer Alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäurelösung auf einer Probenplatte gemischt und getrocknet. Ein weiteres Aliquot wurde für den BCA-Assay entnommen und der Rest der Extrakte wurde getrocknet und bei –20 °C gelagert. Die MALDI-TOF-MS-Analyse wurde mit einem ultrafleXtreme II-System (Bruker Daltonics, Billerica, MA) durchgeführt, das im Positivmodus arbeitete. Der Bereich von m/z 800–6000 wurde im Reflektormodus untersucht. Massenspektren wurden mit der flexAnalysis-Software (Bruker) analysiert. Peaks wurden automatisch mit dem Snap-Peak-Erkennungsalgorithmus und einem S/N-Verhältnis-Schwellenwert von 6 ausgewählt oder manuell ausgewählt, wenn ein beobachtbarer Peak mit einem vorhergesagten oder gemeldeten Peptid übereinstimmt. Wenn nur Hintergrundrauschen beobachtet wurde, wurde der Peak nicht ausgewählt und der Datenpunkt wurde als auf dem Hintergrundpegel liegend markiert und daher nicht für Statistiken verwendet. Identifizierte Peptidlisten wurden erstellt, indem die erfassten Massenlisten mit der vorhergesagten Peptidmasse von UniProt und den Ergebnissen früherer Peptidomics-Studien der Pankreasinseln und Hypophysen abgeglichen wurden, einschließlich Daten aus unserer eigenen Gruppe32,33,34,35,36,37,38. Eine Liste der identifizierten Peptide finden Sie in den Zusatzdaten 1. Peakintensitäten von Salzaddukten ([M+Na]+, [M + K]+) wurden mit der Intensität des protonierten Molekülions [M + H]+ to summiert stellen die Gesamtintensität des Peptids in jedem Spektrum dar. Die summierte Intensität wurde dann auf den Gesamtionenstrom des Spektrums normiert. Unkorrigierte multiple t-Tests wurden verwendet, um die Unterschiede in den auf den Gesamtionenstrom normalisierten Peakintensitäten zwischen der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe zu bestimmen, und die Ergebnisse wurden in Form von Vulkandiagrammen dargestellt, um die Faltungsänderungswerte und die statistische Signifikanz darzustellen.

Der BCA-Gesamtproteingehaltstest wurde an Hypophysen-, Insel- und Azinusgewebeproben entweder mit dem Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher, Kat.-Nr.: 23225) oder dem Micro BCA™ Protein Assay (Thermo Fisher, Kat.-Nr.: 23235) durchgeführt. . Aus rekonstituierten Proben, die für die MALDI-TOF-MS-Analyse vorbereitet wurden, wurde ein Probenvolumen von 1–2 μL entnommen und gemäß dem Protokoll des Herstellers verdünnt. Für Tests wurden Kalibrierungskurven von 0–40 μg/ml erstellt.

Eine Variation von Marfeys Reagenz, Nα-(2,4-Dinitro-5-fluorphenyl)-l-valinamid (FDVA, Kat.-Nr. 42102, Sigma), wurde verwendet, um mit freien Aminen der in den Proben vorhandenen Analyten zu reagieren und so die Trennung zu unterstützen von l/d-Ala mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Analytquantifizierung mittels Massenspektrometrie54. Ein Reaktionsschema und ein Beispiel für die l/d-Ala-Trennung sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Die Derivatisierungsstrategie wurde aufgrund ihrer höheren Empfindlichkeit im Vergleich zur chiralen Säulentrennung an nicht derivatisiertem Alanin gewählt. Getrocknete Proben wurden in 100 oder 120 μl 0,5 M NaHCO3-Lösung rekonstituiert (50 μl für Hypophysenproben, 22 μl für Insel-/Azinusproben). Standardreihen von l/d-Ala (4–800 μM für l und 0,1–40 μM für d), d-Ala-13C3,15N (10 μM–4 mM), l/d-Ala-3,3,3 -d3 (2–400 μM für l und 1–200 μM für d) und l-Ala-2,3,3,3-d4 (1–400 μM) und l-Serin-13C,15N (4 mM). , als interner Standard bei der LC-Injektion) wurden ebenfalls in 0,5 M NaHCO3 hergestellt. FDVA wurde mit einer Analysenwaage abgewogen und in Acetonitril auf eine Endkonzentration von 5–6 mg/ml (1 mg/ml für Insel-/Azinusproben) gelöst. Rekonstituierte Proben wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 g zentrifugiert, und 10 μl-Aliquots von Überständen oder in 0,5 M NaHCO3 verdünnten Überständen wurden mit 10 μl FDVA-Lösung in 0,2-ml-PCR-Röhrchen gemischt (mit Ausnahme von 20-μl-Proben und 20 μl-Proben). FDVA-Lösung für Insel- und Azinusgewebeproben). Die Standards wurden direkt 1:1 mit der FDVA-Lösung im gleichen Volumen gemischt. Die Gemische wurden 3 Stunden lang bei 60 °C in einem Thermocycler Bio-Rad T100 umgesetzt. Nach der Reaktion wurden die Gemische entweder sofort einer Analyse unterzogen oder bis zur Analyse bei –80 °C eingefroren.

Aufgrund der geringen Mengen an unmarkiertem l- und d-Ala, das aus Inseln und Azinusgewebeproben extrahiert wurde, wurden Pierce™ Peptide Desalting Spin Columns (Thermo Fisher, Kat.-Nr.: 89851) zum Entsalzen und Konzentrieren derivatisierter Aminosäuren aus reagierten Inseln und verwendet Azinusgewebeproben. Fertige Marfey-Reaktionen wurden mit dem Eppendorf Vacufuge-Konzentrator getrocknet und in 150 μl 0,1 % TFA in Wasser rekonstituiert, gefolgt von Schritten im Protokoll des Herstellers mit mehreren Modifikationen zur Maximierung der Ausbeute, darunter insgesamt 3 Mal für die Probenbeladung und 4 Mal für Probenelution (2x mit 50:50 ACN:Wasser, 0,1 % TFA, 2x mit 80:20 ACN:Wasser, 0,1 % TFA). Die eluierten Lösungen wurden dann getrocknet und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Eine LC-MS/MS-Analyse wurde im Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus durchgeführt. MRM ermöglicht die Quantifizierung des l/d-Aminosäuregehalts der Proben. Bei MRM-Messungen wurde eine Bruker Elute-Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet, die mit einem Bruker EVOQ-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer gekoppelt war, das im negativen ESI-Modus arbeitete54. Die MRM-Kanäle wurden unter Verwendung von mit FDVA umgesetzten Aminosäurestandards aufgebaut; Einzelheiten zu Quellparametern und MRM-Übergängen finden Sie in den Ergänzungstabellen 4 und 5. Derivatisierte l/d-Aminosäuren wurden mit einer Kinetex® 2,6 µm Phenyl-Hexyl 100 Å, 100 × 2,1 mm-Säule (Phenomenex, Kat.-Nr.: 00D-4495-AN) bei 30 °C. Ein Gradient von 25 mM Ammoniumformiat in Wasser (A) und Methanol (B) wurde mit einer Flussrate von 0,3 ml/min (0,4 ml/min während 9,5–11 min) verwendet. Der Gradient beträgt 0–2 min, 95 % A; 2–3,5 Min., 95–78 % A; 3,5–6 Min., 78–50 % A; 6–9 Min., 50–45 % A; 9–9,5 Min., 45–10 % A; 9,5–11 Min., 10 % A; 11–11,5 Min., 10–95 % A; 11,5–12 Min., 95 % A.

Um eine LC-MS/MS-Analyse durchzuführen, wurden die Reaktionsmischungen 5 Minuten lang bei 4 °C und 16.000 g zentrifugiert und dann 20- bis 80-fach (meistens 40-fach) im Ladepuffer verdünnt, der zu 95 % aus mobiler Phase A bestand. 5 % Acetonitril und 2 μM FDVA-l-Ser-13C,15N als interner Standard bei instrumenteller Injektion. Die Standards wurden durch den Ladepuffer mindestens 40-fach verdünnt. Für alle Proben innerhalb jedes LC-MS-Laufs wurden mindestens zwei technische Probeninjektionen durchgeführt. Für lange kontinuierliche LC-MS-Läufe wurden Kalibrierungskurven am Anfang, in der Mitte und am Ende der gesamten Probenliste erstellt und eine Master-Kalibrierungskurve durch Mittelung aller Kalibrierungskurven zusammengefasst. Die FDVA-Peakflächen wurden für alle Proben überwacht, um die nach den Marfey-Reaktionen verbleibende FDVA-Restmenge zu berechnen und mit Reaktionsblindwerten zu vergleichen. Wenn der FDVA-Gehalt in den Proben (verbleibendes FDVA) weniger als 20 % des Reaktionsblindwerts betrug, was auf mögliche unvollständige Reaktionen hinweist, wurden die rekonstituierten Proben weiter verdünnt und erneut umgesetzt, bis der verbleibende FDVA-Gehalt mehr als 20 % betrug. Der Crosstalk zwischen Kanälen für derivatisiertes unmarkiertes Ala, Ala-13C3, 15N, Ala-2,3,3,3-d4 und Ala-3,3,3-d3 wurde in jedem Versuchsdurchlauf unter Verwendung von Standards bewertet, um sicherzustellen, dass kein beobachteter Crosstalk auftritt Auswirkungen auf die Ergebnisse haben. Alle Proben wurden mindestens zweimal an verschiedenen Tagen von zwei unabhängigen Prüfern gemessen, mit Ausnahme von Insel- und Azinusgeweben aufgrund ihrer geringen Probenmengen.

Zur Quantifizierung wurden von der MS Data Viewer-Software (Bruker) integrierte Peakflächen verwendet. Die abgedeckten Kalibrierungskurven reichen von 0,2–120 pmol für derivatisiertes l-Ala, 0,005–3 pmol für d-Ala, 0,2–200 pmol für d-Ala-13C3,15N und 0,005–2 pmol für l-Ala-3,3,3 -d3, 0,0025–1 pmol für d-Ala-3,3,3-d3, 0,0025–1 pmol für l-Ala-2,3,3,3-d4 und 0,1–30 pmol für l-Leu-5 ,5,5-d3 pro Injektion. Die Peakflächen wurden durch Teilung auf die Peakfläche des derivatisierten l-Ser-13C,15N normalisiert, das in derselben Probe vorhanden war. Lineare Regressionen wurden in geeigneten Bereichen angepasst, die die erkannten Peakbereiche in den unbekannten Proben am besten abdecken. Bei Bedarf wurden lineare Regressionen in zwei Segmenten für denselben Analyten durchgeführt, um den hohen und niedrigen Konzentrationsbereich bestmöglich abzudecken; Für Kalibrierungskurven im niedrigen Konzentrationsbereich wurden die Kalibrierungskurven auf einen Schnittpunkt bei (0,0) eingestellt. Mit wenigen Ausnahmen erreichten alle linearen Regressionen ein R-Quadrat > 0,99. Nach der Quantifizierung der AAs pro Injektion in unbekannten Proben mithilfe von Peakflächen und Kalibrierungskurven wurden die Mengen an unmarkiertem Ala, isotopenmarkiertem Ala und l-Leu-5,5,5-d3 für rekonstituierte Proben und Blindproben berechnet. Die Ergebnisse technischer Replikate wurden gemittelt. Die Analytrückgewinnung nach dem Zentrifugalfiltrationsschritt wurde durch Division der Menge an l-Leu-5,5,5-d3 in unbekannten Proben durch die Menge an l-Leu-5,5,5-d3 in Referenzproben dargestellt und wurde verwendet Berechnen Sie die Ala-Menge in der ursprünglichen Probenextraktion vor der Filtration zurück. Anschließend wurden die Blindwerte von den entsprechenden Extraktionsblindwerten abgezogen. Die Konzentration von unmarkiertem und mit stabilem Isotop markiertem Ala wurde durch Division durch verschiedene Probenmetriken berechnet (z. B. Gewebegewicht in mg für Gehirn/Speicheldrüsen/Därme/Hypophyse/Mäusefutter, Gewicht des Darminhalts in mg, μL für Plasma, Gesamtproteinmengen). für Insel-/Azinusgewebe). Die einzelnen verarbeiteten Werte finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Um Vergleiche zwischen zwei oralen Verabreichungsmodellen und zwischen verschiedenen Probentypen zu ermöglichen, haben wir mehrere Normalisierungsstrategien durchgeführt. Um einen Vergleich zwischen zwei oralen Verabreichungsszenarien zu ermöglichen, wurden die d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen in verschiedenen Geweben/Darminhalten in ihren eigenen Messwerten (pmol über mg Gewebe/mg Kot/μg Proteine) durch die Plasma-d-Ala-13C3 dividiert. 15N-Spiegel (pmol/μL Plasma) (Gleichung 1):

Um Vergleiche zwischen verschiedenen Probentypen zu ermöglichen, da diese unterschiedliche Metriken zur Darstellung der Konzentrationen haben, haben wir die d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen auf die gesamte unmarkierte Ala in jeder Probe aufgeteilt, um sie einheitenlos zu machen. Die d-Ala-13C3,15N-Konzentrationen wurden durch den gesamten unmarkierten Ala in derselben Probe dividiert, wodurch Verhältnisse von d-Ala-13C3,15N zum gesamten unmarkierten Ala in derselben Probe (Gleichung 2) als relative Menge an d-Ala-13C3,15N ermittelt wurden. Ala-13C3,15N:

Eine weitere Normalisierung für die ergänzende Abbildung 2 erfolgte durch Division dieses Verhältnisses durch das Plasma-d-Ala-13C3,15N-Verhältnis, um biologische Variationen zu berücksichtigen (Gleichung 3):

Die in dieser Studie vorgestellten Replikate beziehen sich auf tierische Individuen oder Röhrchen mit Bakterienkulturen. Die in Abbildungen und Statistiken verwendeten Datenpunkte stellen Durchschnittswerte technischer Replikate aus mehreren Messungen dar. Für alle aus LC-MS-Messungen erhaltenen Daten wurden nichtparametrische Statistiken implementiert. Ursprünglich wurden Welch-t-Tests aufgrund ungleicher Stichprobengrößen und/oder ungleicher Varianzen durchgeführt. Aufgrund des geringen Freiheitsgrads der parametrischen Welch-t-Tests aufgrund der geringen Stichprobengröße (n = 3–8) wurden jedoch nichtparametrische Mann-Whitney-Tests für einzelne paarweise Vergleiche ausgewählt. Für Datensätze in Abb. 2, 3c–e, 5b–e, es wurden zweiseitige Mann-Whitney-Tests verwendet. Für die Datensätze in Abb. 5f – j wurden aufgrund der Stichprobengröße (n = 3) und der im Datensatz beobachteten vollständigen Trennung (U = 0) einseitige Mann-Whitney-Tests verwendet. Die nichtparametrische, gepaarte einfaktorielle ANOVA von Friedman, gefolgt von Dunns Mehrfachvergleich, wurde verwendet, um zu bestimmen, ob Gewebetypen signifikant zum d-Ala-13C3,15N-Spiegel beitragen, und um die Unterschiede zwischen Gewebetypen zu untersuchen (Abb. 3f, g). Für Peptidprofilierungsdaten (Abb. 4) wurden unkorrigierte multiple t-Tests mit mehr Annahmen ausgewählt, um die Anzahl der Entdeckungen für zukünftige Studien aufgrund der semiquantitativen Natur von MALDI-TOF MS und der geringen Stichprobengröße (n = 4) zu maximieren. und der explorative Charakter dieses Experiments. Das Signifikanzniveau (α) für alle Statistiken wird bei der Beschreibung der statistischen Signifikanz auf 0,05 festgelegt. Alle Statistiken wurden in GraphPad Prism 9.2.0 erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für alle Grafiken und Diagramme finden Sie in der Ergänzungsdatendatei. Die verarbeiteten Daten, die die Schlussfolgerungen stützen, werden im Haupttext und in den Zusatzinformationen dargestellt. Die Originaldaten sind verfügbar und werden auf Anfrage durch Kontaktaufnahme mit dem entsprechenden Autor oder dem Hauptautor ([email protected]) weitergegeben.

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Die Autoren danken Dr. Fuming Pan und J. Reid McClure von der UIUC Rodent Gnotobiotic Facility für ihre Unterstützung bei keimfreien Tierversuchen. Wir danken Nissa J. Larson für ihre Hilfe bei den BCA-Experimenten und Dr. Peter Chan-Andersen für ihre Hilfe bei massenspektrometrischen Experimenten zur Peptidprofilierung. Wir danken Theren Williams vom Illinois Statistics Office für seine Hilfe bei der Statistik. Diese Arbeit wurde durch ein Beckman Institute Postdoctoral Fellowship an der UIUC der Arnold and Mabel Beckman Foundation und ein Mistletoe Research Fellowship der Momental Foundation (TAQ) sowie durch das Pilot Project Grant Program des Office of the Vice Chancellor for Research der University of Illinois unterstützt , durch Auszeichnung Nr. R01NS031609 des National Institute of Neurological Disorders and Stroke der National Institutes of Health (JVS) und durch Unterstützung des Pathway to Stop Diabetes Grant Nr. 1-18-VSN-19 (JVS) der American Diabetes Association . Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der Fördergeber wieder.

Tian (Herbst) Qiu

Aktuelle Adresse: Department of Chemistry, Michigan State University, East Lansing, MI, USA

Dong-Kyu Lee

Derzeitige Adresse: College of Pharmacy, Chung-Ang University, Seoul, Republik Korea

Fakultät für Chemie, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Tian (Herbst) Qiu, Cindy J. Lee, Dong-Kyu Lee, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova und Jonathan V. Sweedler

Beckman Institute, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Tian (Herbst) Qiu, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova und Jonathan V. Sweedler

Neurowissenschaftliches Programm, University of Illinois Urbana-Champaign, Urbana, IL, USA

Chen Huang, Stanislav S. Rubakhin, Elena V. Romanova und Jonathan V. Sweedler

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Tian (Herbst) Qiu: Konzeptualisierung, Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Projektverwaltung, Finanzierungseinwerbung. Cindy J. Lee: Methodik, Validierung, formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Chen Huang: Formale Analyse, Untersuchung, Schreiben – Originalentwurf. Stanislav S. Rubakhin: Methodik, Validierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. Dong-Kyu Lee: Methodik, Ressourcen, Schreiben – Originalentwurf. Elena V. Romanova: Formale Analyse. Jonathan V. Sweedler: Konzeptualisierung, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Betreuung, Finanzierungsakquise.

Korrespondenz mit Jonathan V. Sweedler.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Jhen-Wei Ruan, Jukka Hintikka und dem anderen anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Mark Collins und Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Qiu, T.(., Lee, CJ, Huang, C. et al. Biodistribution and racemization of gut-absorbed l/d-alanine in keimfreien Mäusen. Commun Biol 6, 851 (2023). https://doi .org/10.1038/s42003-023-05209-y

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Eingegangen: 02. Januar 2023

Angenommen: 03. August 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05209-y

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