Ölsäure als potenzielles Immunstimulans in den Stoffwechselwegen hybrider Zackenbarschjunglinge (Epinephelus fuscoguttatus × Epinephelus lanceolatus), die mit Vibrio vulnificus infiziert sind

Jul 21, 2023

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 12830 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Zackenbarschkultur hat in Malaysia aufgrund der enormen Nachfrage vor Ort und weltweit zugenommen. Aufgrund von Infektionskrankheiten wie Vibriose stieg jedoch die Fischsterblichkeit, was sich auf die Produktion von Zackenbarschen auswirkte. Daher konzentriert sich diese Studie auf die Stoffwechselprofilierung überlebender infizierter Zackenbarsche, die mit unterschiedlichen Formulierungen von Fettsäurediäten gefüttert wurden, die als Immunstimulanzien für die Fische fungierten, um das gewünschte Wachstum und die gewünschte Gesundheitsleistung zu erreichen. Nach einem sechswöchigen Fütterungsversuch und einer einwöchigen postbakteriellen Belastung wurden vom überlebenden infizierten Zackenbarsch Proben für die GC-MS-Analyse entnommen. Zur Metabolitenextraktion wurde eine Extraktionsmethode mit Methanol/Chloroform/Wasser (2:2:1,8) auf die Immunorgane (Milz und Leber) des überlebenden infizierten Zackenbarsches angewendet. Anschließend wurden die Verteilungsmuster der Metaboliten zwischen Versuchsgruppen mithilfe einer Metabolomics-Plattform analysiert. Insgesamt wurden mutmaßlich 50 bzw. 81 Metaboliten aus den Milz- bzw. Leberproben identifiziert. Unsere weitere Analyse ergab, dass in Milz- und Leberproben von überlebenden infizierten Zackenbarschen der Glycin-, Serin- und Threonin-Metabolismus sowie der Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Metabolismus die am stärksten beeinträchtigten Stoffwechselwege waren. Die Metaboliten, die in diesen Signalwegen in großer Menge in der Milz vorkamen, waren Glycin (20,9 %), L-Threonin (1,0 %) und L-Serin (0,8 %). In der Leber wurden L-Glutamin (1,8 %) und Asparaginsäure (0,6 %) in großen Mengen gefunden. Interessanterweise produzierten unter den Fischfuttergruppen mit Ölsäure gefütterte Zackenbarsche im Vergleich zu den Kontrollfuttermitteln mehr Metaboliten mit einem höheren Flächenanteil. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen, dass die Verwendung von Ölsäure als Immunstimulans in der Fischfutterformulierung mehr verschiedene immunbezogene Metaboliten beeinflusst als andere formulierte Futtermittel für mit Vibriose infizierte Zackenbarsche.

Zackenbarsche gehören zu den beliebten tropischen Meeresflossenfischen, die nicht nur in Malaysia, sondern auch in anderen Ländern der asiatisch-pazifischen Region wie Taiwan, Indonesien, China und Japan weithin gezüchtet und gefangen werden1. In Malaysia wurde der hybride Zackenbarsch (E. fuscoguttatus weiblich × E. lanceolatus männlich) erstmals am Borneo Marine Research Institute der Universiti Malaysia Sabah2 gezüchtet. Seitdem hat sich der Hybrid-Zackenbarsch zum am schnellsten wachsenden Meeresflossenfisch im südostasiatischen Raum entwickelt3. Um die Produktivität zu steigern und die Marktnachfrage zu befriedigen, werden Zackenbarsche in vielen Fischfarmen intensiv gezüchtet. Allerdings hatten intensive Marikulturpraktiken wie eine hohe Besatzdichte negative Auswirkungen auf ihre Wachstumsleistung und die Anfälligkeit der Zackenbarsche für Infektionskrankheiten4.

Vibriose gilt als eine der häufigsten Krankheiten, die bei einer Vielzahl kultivierter Meeresfischarten zu erheblichen wirtschaftlichen Verlusten führt4,5. In früheren Studien wurde berichtet, dass die Hauptsterblichkeit in mehreren Zackenbarsch-Aquakulturfarmen durch Vibriose-Infektionen verursacht wurde6,7,8,9,10,11. Einem früheren Bericht zufolge war eine Vibriose-Infektion bei Zuchtzackenbarschen in Malaysia weit verbreitet, wo das Vorkommen von Vibrio spp. darunter Vibrio communis (28 %), Vibrio parahaemolyticus (25 %), Vibrio alginolyticus (19 %) und Vibrio vulnificus (14 %), wurden hauptsächlich in Zackenbarschfarmen nachgewiesen10. In einer anderen Studie hatte ein Ausbruch von Vibriose zu einer Sterblichkeit von mehr als 50 % bei in Tiefseekäfigen in Langkawi kultivierten Zackenbarschen geführt. Aus dem Bericht gehen zwei wichtige Vibrio-Arten hervor. identifiziert, darunter V. vulnificus und V. alginolyticus12. Nach einer Infektion mit Vibrio entwickeln Fische normalerweise mehrere Symptome, darunter Hautverfärbung, äußere Blutung, Kiemennekrose, Hautläsionen, hämorrhagische Leber und schließlich Letalität13,14. Abgesehen von Infektionen von Wassertieren können Vibrio spp. auch für die kontaminierten Lebensmittel, insbesondere Meeresfrüchte, verantwortlich. Vibrio vulnificus, V. parahaemolyticus und Vibrio cholerae gehören zu den häufigsten lebensmittelbedingten Infektionen beim Menschen15.

Im Allgemeinen wurden aktuelle Ansätze wie Antibiotika zur Kontrolle und Vorbeugung von Infektionen mit Krankheitserregern eingesetzt. Dennoch stellt das Auftreten antibiotikaresistenter Bakterienstämme eine ernsthafte Herausforderung für die Wirksamkeit von Antibiotika dar16. In einer anderen Studie können einige Antibiotika oxidative Stresseffekte bei Fischen verursachen, zum Beispiel das Florfenicol, das die Superoxiddismutase (SOD), Katalase (CAT) und Malondialdehyd (MDA) des Europäischen Wolfsbarschs (Dicentrarchus labrax) erhöhte17. Die Anhäufung und das Ungleichgewicht dieser freien Radikale könnten zu Zell- und Gewebeschäden führen18. Aus diesem Grund ist es unerlässlich, neue Alternativen zu finden, die gezüchteten Wassertieren eine gute Ernährung bieten und gleichzeitig die Lebensmittelqualität, -sicherheit und ökologische Nachhaltigkeit gewährleisten. Da der Einsatz von Antibiotika in der Aquakultur einige Einschränkungen aufwies, lieferte die Entwicklung von Zusatzstoffen wie Aminosäuren, organischen Säuren und Fettsäuren als Immunstimulans neue Erkenntnisse und Strategien zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten in der Fischkultur19. Laut Sankian et al.20 zeigte ein Fütterungsexperiment an Mandarinenfischen, Siniperca scherzeri mit Sojaöl und Leinöl, die Fettsäurekomponenten wie Ölsäure, Linolsäure und α-Linolsäure enthalten, eine bemerkenswerte Verbesserung ihres Überlebens und Wachstums Leistung. Aus unserer vorherigen Studie geht hervor, dass wichtige Metaboliten aus der Fettsäuregruppe, nämlich Ölsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Behensäure, Palmitoleinsäure, cis-Erucasäure und 8,11-Eicosadiensäure, in Zackenbarschen, die die V. überlebten, reichlich vorhanden sind. vulnificus-Infektion21. Dieser Befund steht im Einklang mit der Studie von Natnan et al.22, die zeigten, dass die exogene Zufuhr von Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und Behensäure in der Futterformulierung die Immunantwort verstärken und gleichzeitig zur Verbesserung des Überlebens beitragen kann22.

Frühere Übersichten zu Omics-Strategien tragen zur Verbesserung zahlreicher Aspekte der Wertschöpfungskette der Aquakultur bei, indem sie nicht nur die genetischen Variationen der Fische verstehen, sondern auch die wichtigsten Metaboliten und Proteinexpressionsänderungen, die an der Immunantwort auf infektiöse Fischkrankheiten beteiligt sind23. In den Überprüfungen wurde dargelegt, dass der Einsatz von Omics-Anwendungen wichtige Beiträge zur künftigen Verbesserung der Produktivität und Qualität der Fischzucht liefert24,25. In dieser Studie wurde ein metabolomischer Ansatz unter Verwendung der GC-MS-basierten Metabolomics-Techniken ausgewählt, da er reproduzierbare molekulare Fragmentmuster mit hoher chromatographischer Auflösung und einer robusten Datenbank aus identifizierten Peaks generiert, die direkt dazu beitragen, Informationen über Stoffwechselreaktionen und -wege der Fische zu liefern weitere Entdeckungen der physikalischen und biochemischen Eigenschaften von Fischen26, insbesondere als Reaktion auf die Vibriose-Erkrankung. In dieser Studie wurde auch versucht, die Metaboliten des überlebenden infizierten Zackenbarsches zu charakterisieren und gezielt anzusprechen, der mit vier verschiedenen Fettsäure-Immunstimulanzien gefüttert wurde.

Nach sechs Wochen Fütterungsversuch und einer Woche postbakterieller Belastung wurde die Überlebensrate der Zackenbarsche in jeder Fütterungsgruppe berechnet. Es gibt einen signifikanten Anteil an Ölsäure-Diät (63,3 %), Stearinsäure-Diät (53,3 %), Palmitinsäure-Diät (53,3 %), Behensäure-Diät (50,0 %) und Kontrolldiät (43,3 %). Abbildung 1 zeigt die Kolonien von Vibrio sp. wuchs auf der TCBS-Agarplatte. Die gelblichen Kolonien deuteten auf das Vorhandensein von Vibrio sp. hin. Bakterien, die aus mit V. vulnificus infizierten Fischproben isoliert wurden.

Vibrio wächst auf der TCBS-Agarplatte, die von der Fischkieme abgestrichen wurde.

Die GCMS-basierte Metabolomics-Analyse wurde an Leber- und Milzproben des überlebten infizierten Zackenbarsches durchgeführt. Abbildung 2 zeigt die gesamten in Leber und Milz identifizierten Metaboliten. In den Leber- und Milzproben des infizierten Zackenbarsches wurden insgesamt 91 Metaboliten identifiziert, die zu mehreren Hauptklassen gehören, darunter Aminosäuren (25,3 %), Kohlenhydrate (22,0 %), Fettsäuren (6,6 %) und eine organische Verbindung (27,5 %). Darüber hinaus wurden andere Metaboliten (18,7 %) in Aldehyd, Alkan, Nitril, anorganische Verbindungen, Kohlenwasserstoff, Siloxan, Pyrimidin und Monocarbonsäure eingeteilt. In der Leber wurden 81 Metaboliten identifiziert, während in der Milz nur 50 Metaboliten identifiziert wurden.

Vergleich der insgesamt identifizierten Metaboliten zwischen Leber und Milz.

Abbildung 3 zeigt den Vergleich der gesamten Metaboliten in der Leber und der Milz eines überlebenden infizierten Zackenbarsches, der mit fünf unterschiedlich formulierten Diäten gefüttert wurde. Aus dem Ergebnis geht hervor, dass die höchste Anzahl an Metaboliten in der Leber bei Zackenbarschen festgestellt wurde, die mit der Ölsäure-Diät (49 Metaboliten) gefüttert wurden, gefolgt von anderen Diätgruppen mit Fettsäure-Formulierung, einschließlich Palmitinsäure; 45 Metaboliten, Behensäure; 37 Metaboliten, Stearinsäure; 42 Metaboliten und Kontrolle; 42 Metaboliten. Unterdessen wurde in der Milz die höchste Anzahl an Metaboliten identifiziert, die bei Zackenbarschen festgestellt wurden, die mit der Kontrolldiät gefüttert wurden (39 Metaboliten), gefolgt von der Palmitinsäure-Diät (29 Metaboliten), der Behensäure-Diät (25 Metaboliten) und der Ölsäure-Diät (24 Metaboliten). und Stearinsäure-Diät (20 Metaboliten).

Der Vergleich der gesamten identifizierten Metaboliten in der Leber- und Milzprobe des infizierten Zackenbarsches entsprach unterschiedlicher Futterformulierung C; gefüttert mit der Kontrolldiät, OA; gefüttert mit der Ölsäure-Diät, PA; gefüttert mit der Palmitinsäure-Diät, BA; gefüttert mit der Behensäure-Diät und SA; mit der Stearinsäure-Diät gefüttert. Unterschiedliche Buchstaben bedeuten einen signifikanten Unterschied (p < 0,05) und * bedeutet keinen signifikanten Unterschied zwischen den Ernährungsgruppen (p > 0,05).

Zwei Hauptklassen, bestehend aus Aminosäuren und Kohlenhydraten, zeigten von allen Fütterungsgruppen die meisten in Leber und Milz nachgewiesenen Metaboliten, was darauf hindeutet, dass Fische als Reaktion auf die Vibrio-Infektion wichtige Metaboliten produzierten. In der Kontrolldiät wurden in den Leberproben (14) im Vergleich zu den Milzproben (11) höhere Kohlenhydratmetaboliten nachgewiesen. Die Gesamtzahl der Aminosäuremetaboliten in Leber und Milz betrug 9 bzw. 13. Fettsäuremetaboliten wiesen den niedrigsten Metabolitennachweis auf, wobei ein Metabolit in Leber und Milz der Kontrolldiätgruppe nachgewiesen wurde. Bei Zackenbarschen, die mit Ölsäure gefüttert wurden, wurden im Vergleich zu anderen Futtergruppen die meisten Aminosäuremetaboliten in der Leber (15) und in der Milz (10) nachgewiesen. Der Zackenbarsch, der sich von Ölsäure ernährte, wies auch viele andere Metaboliten in der Leber auf, darunter Kohlenhydrate (13), Fettsäuren (6) und organische Säuren (9). Unterdessen wurden in der Milz geringere Metaboliten nachgewiesen, darunter Kohlenhydrate (6) und organische Säuren (4). Bei anderen Nahrungsformulierungen, einschließlich Palmitinsäure, Behensäure und Stearinsäure, wurden Metaboliten in ähnlichen Mengen nachgewiesen, wobei in Leberproben höhere Mengen als in Milzproben nachgewiesen wurden (Abb. 3).

Für diese nicht normalverteilten Daten wurde mit dem Statistiksoftwareprogramm SPSS 25.0 der nichtparametrische Kruskal-Wallis-Test durchgeführt. Die Analyse zeigte, dass die fünf formulierten Diäten keine signifikante Wirkung (p > 0,05) auf dieselbe Gruppe von Metaboliten hatten. Bei der Analyse verschiedener Gruppen von Verbindungen zeigten ihre Gesamtmetaboliten jedoch unterschiedliche Signifikanzwerte (p < 0,05).

Eine Liste aller identifizierten Metaboliten ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. Nachfolgend sind die prozentualen Anteile der Metaboliten in Leber- und Milzproben aufgeführt. In der Leber wurden Kohlenhydratverbindungen einschließlich D-Galactose (im Bereich von 41,5 % bis 58,2 %) in höheren Konzentrationen produziert, gefolgt von D-Glucose (im Bereich von 7,5 % bis 11,0 %) und Thymol-α-d-glucopyranosid (im Bereich von). 4,2 % bis 10,9 %), D-Mannose (im Bereich von 1,8 % bis 7,9 %) und D-Ribose (im Bereich von 1,3 % bis 1,9 %). Ähnliche Metaboliten wurden auch in der Milz gefunden, wo D-Galactose (im Bereich von 21,0 % bis 45,9 %) in höheren Konzentrationen produziert wurde, gefolgt von D-Glucose (im Bereich von 7,0 % bis 10,5 %) und Thymol-α-d-glucopyranosid (im Bereich von 5,3 % bis 8,3 %), D-Mannose (im Bereich von 1,0 % bis 4,7 %) und D-Ribose (im Bereich von 2,2 % bis 3,6 %).

Bezüglich der Aminosäureverbindungen zeigte sich, dass Glycin (im Bereich von 7,9 % bis 13,7 %) im Vergleich zu anderen Diätgruppen den höchsten prozentualen Anteil in den Leberproben aufwies (Ergänzungstabelle 1). Es folgten L-Valin (1,9 %), L-Glutamin (zwischen 0,4 % und 1,8 %), N-α-Acetyl-L-Lysin (zwischen 0,4 % und 1,7 %) und L-Threonin (zwischen 0,4 % und 1,7 %). 0,2 % bis 0,9 %), L-Leucin (0,1 % bis 0,7 %), L-Serin (im Bereich von 0,2 % bis 0,4 %) und L-Isoleucin (im Bereich von 0,1 % bis 0,3 %). In ähnlicher Weise hat Glycin (im Bereich von 14,2 % bis 20,9 %) die höchste prozentuale Fläche, gefolgt von L-Valin (0,1 % bis 12,31 %), L-Glutamin (im Bereich von 1,6 % bis 6,4 %), L-Asparaginsäure (im Bereich von 2,2 % bis 3,6 %), L-Alanin (im Bereich von 1,8 % bis 3,2 %), Pyroglutaminsäure (1,2 %), L-Threonin (0,4 % bis 1,0 %) und L-Serin (0,3 %). % bis 0,8 %). Ölsäuremetaboliten (1,49 %) können nur in Leberproben von Zackenbarschen gefunden werden, die mit Ölsäure gefüttert wurden. Die meisten Fettsäuren finden sich auch in der mit Zackenbarschen gefütterten Nahrung, darunter Ölsäure. Octadecansäure (0,2 %), Hexadecansäure (3,17 %) und 9,12-Octadecadiensäure (0,4 %). (Ergänzungstabelle 1).

Die Verteilung der deutlich unterschiedlichen Metaboliten ist unten im Venn-Diagramm dargestellt. Basierend auf Abb. 4 wurde eine höhere Anzahl einzigartiger Metaboliten in der Leber identifiziert, wobei insgesamt 41 Metaboliten im Vergleich zu 10 Metaboliten in der Milz des überlebten infizierten Zackenbarsches identifiziert wurden. Es wurde auch beobachtet, dass 40 Metaboliten sowohl in der Leber als auch in der Milz von überlebten infizierten Zackenbarschen vorhanden sind.

Venn-Diagramm der Gesamtverteilung der Metaboliten in der Leber und der Milz von überlebten infizierten Zackenbarschen bei allen Fütterungsbehandlungen.

Unterdessen zeigte das in Abb. 5 gezeigte Venn-Diagramm umfassendere Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Metaboliten in der Leber und der Milz von überlebten infizierten Hybrid-Zackenbarschen für fünf unterschiedlich formulierte Diäten. Gemäß Abb. 5 wurden in der Leber aller Diätgruppen insgesamt 21 Metaboliten erfolgreich nachgewiesen, darunter sechs Aminosäuren (L-Glutamin, Glycin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Threonin und L-Serin). , acht Kohlenhydrate (α-D-Galactopyranose, α-D-Mannopyranosid, D-Galactose, D-Glucose, D-Ribose, Glucopyranose, D-Mannose und Thymol-Alpha-D-Glucopyranosid), fünf organische Verbindungen (Äpfelsäure). , Pentandisäure, Butandisäure, Silanamin und 1,4-Butandiol) und zwei weitere Metaboliten (Silanol und Trisiloxan). Darüber hinaus produzieren Zackenbarsche, die mit Ölsäure gefüttert werden, die höchste Anzahl einzigartiger Metaboliten (10 Metaboliten). In dieser Studie beziehen sich die einzigartigen Metaboliten auf diejenigen Metaboliten, die nur in einer bestimmten Ernährungsgruppe identifiziert wurden. Von den einzigartigen Metaboliten, die aus der Leber von mit Ölsäure gefütterten Zackenbarschen extrahiert werden, stammen die identifizierten Metaboliten aus der Fettsäuregruppe bestehend aus Hexandisäure, 9,12-Octadecadiensäure, Octadecansäure, Ölsäure und trans-13-Octadecensäure. Weitere einzigartige Metaboliten wurden aus der Gruppe der Aminosäuren (Asparaginsäure, DL-Ornithin, L-Valin) und der Gruppe der anorganischen Verbindungen (Kohlensäure und Heptasiloxan) identifiziert.

Das Venn-Diagramm stellt die Ähnlichkeiten und Unterschiede der identifizierten Metaboliten dar, die aus zwei Immunorganen (Leber und Milz) eines infizierten Hybrid-Zackenbarsches stammen, der mit fünf unterschiedlich formulierten Diäten gefüttert wurde. C; infiziert und mit der Kontrolldiät OA gefüttert; infiziert und gefüttert mit Ölsäure, PA; infiziert und gefüttert mit Palmitinsäure, BA; infiziert und mit Behensäure und SA gefüttert; infiziert und mit Stearinsäure gefüttert.

Wie in den Milzproben (Abb. 5) wurden in allen fünf Diätgruppen 12 Metaboliten erfolgreich identifiziert, darunter fünf aus der Aminosäureklasse (L-Alanin, L-Threonin, L-Leucin, L-Serin und δ-Aminolävulinsäure). Säure), drei aus der Kohlenhydratklasse (D-Galactose, D-Glucose und D-Ribose) und vier aus anderen Metabolitenklassen wie organischen und anorganischen Metaboliten (Pentandisäure, Silanamin, Silanol und 6-Hydroxy-2-aminohexansäure). ). Im Gegensatz zu den Leberergebnissen wurde die höchste Anzahl einzigartiger Metaboliten bei Zackenbarschen produziert, die mit einer Kontrolldiät gefüttert wurden (acht Metaboliten), gefolgt von Zackenbarschen, die mit einer Ölsäurediät gefüttert wurden (fünf Metaboliten). Die einzigartigen Metaboliten, die aus der Milz des Zackenbarsches extrahiert wurden, der mit einer Kontrolldiät gefüttert wurde, bestanden aus Aminosäuren (Cystein und L-Methionin), Kohlenhydraten (α-D-Mannopyranosid und D-Fructose), Fettsäure (Propansäure) und organischen Verbindungen (Pipecolinsäure, Pyrimidin und Phosphorsäure). Bei Zackenbarschen, die mit Ölsäure gefüttert werden, stammen die identifizierten Metaboliten hingegen aus der Aminosäuregruppe Pyroglutaminsäure, D-Prolin und D-Leucyl-D-Leucin, während aus der Gruppe der organischen Verbindungen die Metaboliten 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure und Tris stammen (Trimethylsiloxy)ethylen.

Vergleiche zwischen Leber- und Milzmetaboliten wurden mit der Hauptkomponentenanalyse (PCA) und der partiellen Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (PLS-DA) durchgeführt. Hier wurde über PCA und PLS-DA ein Trennungsmuster zwischen Organen beobachtet, wobei der Gesamtvarianzprozentsatz für PCA (R2X = 0,427, R2Y = 0,083) und PLS-DA-Analyse (R2X = 0,305, R2Y = 0,192) 51,0 % und 49,7 betrug % jeweils. Wie aus Abb. 6a hervorgeht, zeigte das PCA-Diagramm nach der Belastung mit V. vulnificus keine deutlichen Cluster zwischen Leber- und Milzmetaboliten. Darüber hinaus zeigt eine weitere Analyse unter Verwendung des PLS-DA-Diagramms wie in Abb. 6b, dass zwischen Leber- und Milzmetaboliten unterschieden wird. Diese Beobachtung legt nahe, dass Metaboliten als Reaktion auf eine Vibrio-Infektion ausschließlich zwischen Leber und Milz produziert werden. Für die Leber- und Milzdaten wurde eine Modellfernanalyse (DModX) durchgeführt, da beobachtet wurde, dass sich LBA2 und LSA3 von anderen unterschieden. Anhand des Ergebnisses konnte festgestellt werden, dass der DModX-Wert niedriger als D-Crit war und die Wahrscheinlichkeit eines Konfidenzintervalls von 95 % darauf hinweist, dass die Proben zur Modellprobengruppe und nicht zu Ausreißern gehörten. Der variable Einfluss auf die Projektion (VIP) wurde aus einer PLS-DA-Analyse generiert. Abbildung 6c wurde verwendet, um Metaboliten zu identifizieren, die für die Unterschiede in Leber- und Milzorganen von Bedeutung sind. Abbildung 6c zeigt die Hauptmetaboliten mit einem VIP-Score-Wert von mehr als eins, die zur Trennung zwischen Organen beitragen, einschließlich L-Alanin, 1,4-Butandiol, Hexadecansäure, α-D-Mannopyranosid, Propandisäure, L-Lysin, L- Tyrosin, Butandisäure, α-D-Galactopyranose, 6-Hydroxy-2-aminohexansäure und Silanol.

PCA-Score-Diagramm (a) und PLS-DA-Score-Diagramm (b) für Leber- und Milzmetaboliten, die das Trennungsmuster zweier verschiedener Organe darstellen. Leberprobe (grün), Milzprobe (blau). PLS-DA-Ladediagrammanalyse (c) von Metabolitenprofilen aus Leber und Milzorgan.

Weitere Analysen mittels PCA- und PLS-DA-Score-Plot für Leber und Milz wurden durchgeführt, um die Diskriminierungsmuster zwischen fünf verschiedenen Ernährungsgruppen zu bestimmen. Wie in den Abb. gezeigt. 7a,b wurde eine ähnlich klare Trennung zwischen den Fütterungsgruppen mittels PCA- und PLS-DA-Analyse mit dem Gesamtvarianzprozentsatz der Leber für PCA (R2X = 0,335, R2Y = 0,159) und PLS-DA (R2X = 0,335, R2Y =) beobachtet 0,157) betrugen 49,4 % bzw. 49,2 %. Bei den Milzproben zeigte Abb. 8a, dass das PCA-Score-Diagramm nicht richtig gruppiert ist, was möglicherweise an der geringen Größe der Milzproben liegt, die dazu führt, dass die Menge der extrahierten Metaboliten verringert wurde und die Identifizierung der Metaboliten vielfältiger war. Hier wies das PCA-Score-Plot-Ergebnis einen Gesamtvarianzprozentsatz (R2X) von 40,9 % auf, wobei der Score-Wert des ersten PCs (PC1) 0,243 betrug, während der zweite PC (PC2) einen Wert von 0,166 hatte. Anschließend wurde jedoch eine überwachte Methode oder eine PLS-DA-Analyse weiter durchgeführt, und das Ergebnis zeigte eine deutliche Trennung zwischen fünf Diätgruppen mit einem Gesamtvarianzprozentsatz von 36,2 % (RX2 = 0,177, R2Y = 0,185) (Abb. 8b).

PCA-Score-Diagramm (a) und PLS-DA-Score-Diagramm (b) für Lebermetaboliten, die das Trennungsmuster von fünf verschiedenen Probengruppen darstellen. 1 (grün) – Kontrolle (infiziert und mit Kontrolldiät gefüttert), 2 (dunkelblau) – PA (infiziert und mit Palmitinsäure gefüttert), 3 (rot) – BA (infiziert und mit Behensäure gefüttert), 4 (gelb) – SA (infiziert und mit Stearinsäure gefüttert) und 5 (hellblau) – OA (infiziert und mit Ölsäure gefüttert).

PCA-Score-Diagramm (a) und PLS-DA-Score-Diagramm (b) für Milzmetaboliten, die das Trennungsmuster von fünf verschiedenen Probengruppen darstellen. 1 (grün) – Kontrolle (infiziert und mit Kontrolldiät gefüttert), 2 (dunkelblau) – PA (infiziert und mit Palmitinsäure gefüttert), 3 (rot) – BA (infiziert und mit Behensäure gefüttert), 4 (gelb) – SA (infiziert und mit Stearinsäure gefüttert) und 5 (hellblau) – OA (infiziert und mit Ölsäure gefüttert).

Unter Bezugnahme auf die PLS-DA-Score-Plot-Ergebnisse für Leber und Milz (Abb. 7b und 8b) wurden drei unterschiedliche Cluster unter den überlebenden infizierten Zackenbarschen beobachtet, die mit fünf unterschiedlich formulierten Diäten gefüttert wurden. Insbesondere war in den Leberproben die Palmitinsäure-Diätgruppe mit der Stearinsäure-Diätgruppe geclustert, die Behensäure-Diätgruppe mit der Ölsäure-Diätgruppe, während die Kontrolldiätgruppe weiter entfernt war. In der Milzprobe war Palmitinsäure mit Behensäure und Stearinsäure gehäuft, während die Ölsäuregruppe und die Kontrollgruppe weiter voneinander entfernt waren. Es wurde beobachtet, dass die Metaboliten, die von überlebten infizierten Zackenbarschen produziert wurden, die mit einer Ölsäurediät gefüttert wurden, einzigartig sind, da sie von den anderen Fettsäurediäten weiter verteilt waren, insbesondere im Vergleich zur Kontrolldiät. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass Zackenbarsche, die mit einer Ölsäure-Diätformulierung gefüttert wurden, zur Aktivierung der Immunantwort während einer Vibrio-Infektion beitrugen. Der Befund war mit unseren vorherigen Ergebnissen vergleichbar, bei denen unter den verschiedenen an Fischen getesteten Fettsäurediäten die Ölsäureformulierungsdiät laut immunologischen Tests eine deutlich höhere Aktivität der Immunantwort zeigte, was darauf hindeutet, dass Ölsäure die Immunantwort der Fische verstärken kann22.

Die Metaboliten, die den Trennungstrend in den Score-Plots beeinflussen, sind in Abb. 9 zu finden. Diskriminierungsmetaboliten wurden aus normalisierten Daten unter Verwendung eines statistisch signifikanten Schwellenwerts für VIP-Werte (Variable Importance in Project) ermittelt, die aus dem PLS-DA-Modell ermittelt wurden. Die p-Werte wurden durch eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) berechnet. Die Werte von mehr als eins für Leber- und Milzmetaboliten sind wie in Abb. 9 rot markiert.

Von PLS-DA abgeleitete Belastungsdiagrammanalyse von Leber- (a) und Milz-Metaboliten (b) für fünf verschiedene Diätgruppen. Rot markierte Verbindungen weisen auf Metaboliten mit einem VIP-Wert von mehr als 1 hin.

In Tabelle 1 finden sich 23 Verbindungen mit einem VIP-Wert von mehr als eins in der Leber und 12 Verbindungen mit einem VIP-Wert von mehr als eins in der Milz. Der VIP-Score-Wert von mehr als eins stellt den Beitrag der Variablen zur Schätzung und Unterscheidung von Metaboliten zwischen den Stichprobenklassen dar, bei denen es sich in dieser Studie um die verschiedenen Arten formulierter Diäten handelt. Sowohl in der Leber als auch in der Milz kommen vier Klassen von Metaboliten vor, darunter Glycin (Aminosäure), D-Galactose (Kohlenhydrat), Propansäure (Fettsäure), 4-Aminomethylcyclohexancarbonsäure und Silanamin (organische Verbindung). Das PLS-DA-Beladungsdiagramm in Abb. 9a, b zeigt die Unterscheidung von VIP-Metaboliten, die zu den Unterschieden zwischen der Fütterungsbehandlung in den Leber- und Milzproben beiträgt.

Eine multivariate Analyse wurde mittels hierarchischer Clusteranalyse (Heatmap) durchgeführt, um die Variation der in Leber und Milz exprimierten Metaboliten aller überlebenden infizierten Zackenbarsche zu untersuchen, die mit fünf unterschiedlich formulierten Diäten gefüttert wurden (Abb. 10). Der offensichtliche Unterschied besteht zwischen der Kontrollgruppe und anderen Fettsäuregruppen. Es wurde beobachtet, dass der Zackenbarsch, der Nahrungsfettsäuren (Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und Behensäure) zu sich nahm, im Vergleich zur Kontrollgruppe in den Leberproben eine relativ hohe Intensität an Metaboliten aufwies (Abb. 10a). In ähnlicher Weise wurde in den Milzproben beobachtet, dass der Zackenbarsch, der mit Nahrungsfettsäuren (Ölsäure-Diät, Palmitinsäure und Behensäure) gefüttert wurde, im Vergleich zur Diät der Kontrollgruppe eine relativ hohe Intensität an Metaboliten aufwies, mit Ausnahme des Zackenbarsches, der mit Stearinsäure gefüttert wurde Diät, die die geringste Intensität an Metaboliten aufweist als andere Fütterungsgruppen (Abb. 10b).

Hierarchische Clusteranalyse der nachgewiesenen Metabolitenverbindungen aus der Leber (a) und der Milz (b) von überlebten infizierten Zackenbarschen, die mit fünf verschiedenen Futterformulierungen gefüttert wurden. Die braune Farbe weist auf eine relativ hohe Häufigkeit hin, die blaue Farbe auf eine relativ geringe Häufigkeit.

Die Analyse der Anreicherung von Stoffwechselwegen wurde in der Leber und der Milz von überlebenden infizierten Zackenbarschen mit MetaboAnalyst 5.0 durchgeführt und der KEGG-Wegdatenbank unterzogen. Die statistische Analyse der Stoffwechselwege wurde auf p < 0,05 für einen signifikanten Unterschied der unterschiedlichen Metaboliten und Stoffwechselweg-Auswirkungswerte bei 0,1 > 1,0 festgelegt. Der Auswirkungswert ist der Pfadauswirkungswert, der anhand der Pfadtopologieanalyse berechnet wird. Beim Vergleich des Signalweg-Auswirkungswerts (0,1 > 1,0) wurde daher beobachtet, dass der Linolsäurestoffwechsel den höchsten Auswirkungswert auf die Leber hatte (Abb. 11a), während in der Milz die Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Biosynthese beobachtet wurde Höchster Auswirkungswert (Abb. 11b). Es war bekannt, dass der Stoffwechselweg mit einem Auswirkungswert > 0,1 als die relevantesten Stoffwechselwege angesehen wird, die an den in der Studie untersuchten Erkrankungen beteiligt sind.

Einfluss auf den Stoffwechselweg und statistische Signifikanz der Stoffwechselwege, die durch Analyse der Stoffwechselweganreicherung der Metaboliten identifiziert wurden. Leberprobe (a); Milzprobe (b). Die Y-Achse zeigt einen negativen Logarithmus des p-Werts (p < 0,05), was darauf hinweist, dass Pfade mit höherer statistischer Signifikanz im Diagramm weiter oben dargestellt werden.

Von den dreiunddreißig potenziellen Stoffwechselwegen, die in den Leberproben identifiziert wurden (Ergänzungstabelle 2), zeigen vier Wege einen angereicherten signifikanten Unterschied (p <0,05) basierend auf den unterschiedlichen Metaboliten, einschließlich Aminoacyl-tRNA-Biosynthese, Valin-, Leucin- und Isoleucin-Biosynthese. Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel und Biosynthese ungesättigter Fettsäuren (Tabelle 2). Unterdessen zeigten in den Milzproben von vierunddreißig identifizierten potenziellen Stoffwechselwegen (Ergänzungstabelle 3) sieben Wege einen signifikanten Unterschied (p <0,05), der auf der Grundlage der unterschiedlichen Metaboliten, einschließlich Aminoacyl-tRNA-Biosynthese, Valin und Leucin, angereichert war und Isoleucin-Biosynthese, Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Metabolismus, Glyoxylat- und Dicarboxylat-Metabolismus, Glycin-, Serin- und Threonin-Metabolismus und Arginin-Biosynthese (Tabelle 2).

Unter diesen Stoffwechselwegen zeigten jedoch vor allem der Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel signifikante Unterschiede (p < 0,05), wobei der höchste Auswirkungswert bei 0,35 in der Leber lag (Tabelle 2). In der Milz hingegen zeigten der Glycin-, Serin- und Threonin-Metabolismus signifikante Unterschiede (p < 0,05) mit dem höchsten Auswirkungswert von 0,45 (Tabelle 2). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Stoffwechselweg in der Leber sowie der Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechselweg in der Milz eine Rolle bei der Resistenz der Fische gegen Vibrio-Infektionen spielen.

Basierend auf Abb. 12 zeigt die Signalwegkarte die relevanten Netzwerke der Stoffwechselwege zusammen mit den entsprechenden unterschiedlichen Metabolitenintensitäten in den Leber- und Milzproben des überlebten infizierten Zackenbarsches, der mit fünf verschiedenen Arten von Diätformulierungen gefüttert wurde. Die hohen Metabolitenintensitäten können bei Zackenbarschen beobachtet werden, die mit einer Fettsäure-Diätformulierung gefüttert werden, während niedrige Metabolitenintensitäten bei Zackenbarschen beobachtet werden können, die mit einer Kontrolldiät gefüttert werden. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Kontroll- und Fettsäurediäten eine unterschiedliche Metabolomhäufigkeit aufweisen, die möglicherweise mit der Immunantwort der Fische zusammenhängt. Unter diesen in Abb. 12 dargestellten angereicherten Stoffwechselwegen wurde der Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel als der bedeutendste und am stärksten betroffene Stoffwechselweg identifiziert (Tabelle 2). Dies steht im Einklang mit der hohen Häufigkeit von L-Glutamin- und Asparaginsäure-Metaboliten, die in der Leber des überlebten infizierten Zackenbarsches gefunden wurden, der mit der Ölsäure-Diät gefüttert wurde. Bei Milzproben wurde gezeigt, dass der angereicherte Stoffwechselweg, nämlich der Glycin-, Serin- und Threonin-Metabolismus, den am stärksten beeinflussten Stoffwechselweg unter den signifikanten Stoffwechselwegen aufweist (Tabelle 2). Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der hohen Häufigkeit von Glycin, L-Threonin und L-Serin in der Milzprobe von Zackenbarschen, die mit Ölsäure-Diät gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolldiät, wie in Abb. 12 dargestellt.

Integrierte Signalwege tragen zur Immunantwort des Zackenbarsches auf eine Vibrio-Infektion bei, basierend auf der Intensität des Metaboliten in den Leber- und Milzproben des überlebten infizierten Zackenbarsches. Blau stellt Pfade in Leber und Milz dar, die zum Überleben des Zackenbarsches beigetragen haben. Grün stellt Wege dar, die zum Überleben des Zackenbarsches beitragen und nur in der Leber zu finden sind. Orange stellt Signalwege dar, die zum Überleben des Zackenbarsches beitragen und nur in der Milz zu finden sind. Blaue und rote Kästchen stellten erhöhte und verringerte Intensitäten von Metaboliten in den Leber- und Milzproben für den überlebten infizierten Zackenbarsch dar, der mit fünf verschiedenen Fischfuttermitteln gefüttert wurde. Ein Kästchen stellt die durchschnittlichen Replikate dar, die in der Studie verwendet wurden, und ihre entsprechenden Intensitäten.

In dieser Studie wurden vier Fettsäuren, nämlich Ölsäure, Palmitinsäure, Behensäure und Stearinsäure, als Immunstimulanzien in der Formulierung von Fischfutter verwendet. Es ist bekannt, dass Fische in verschiedenen Lebensstadien Fettsäuren benötigen, um ihren spezifischen Nährstoffbedarf zu decken27. Darüber hinaus waren Fettsäuren in der Lage, Immunantworten zu manipulieren, indem sie verschiedene Prozesse auslösten, darunter Genregulation, Membranflüssigkeit, Lipidperoxidation und Eicosanoidproduktion zum Aufbau der Zellmembran28. In unserer Studie wurden die Auswirkungen der Fischfutterformulierung beobachtet und untersucht, um den Zusammenhang zwischen Stoffwechselveränderungen und der Verabreichung von Immunstimulanzien zu vergleichen. Mehrere Studien hatten auch gezeigt, dass die Verwendung von Immunstimulanzien die Stoffwechselaktivitäten der Fische beeinflussen und gleichzeitig ihre Immunreaktionen auf Infektionskrankheiten verstärken kann29,30,31,32. Leber und Milz wurden für die Metabolomik-Analyse ausgewählt, da die Organe eng mit dem Darm-assoziierten Lymphgewebe (GALT) verbunden sind, das verschiedene immun- und nicht-immunbezogene Enzyme produziert. Darüber hinaus interessiert uns auch ihre Beteiligung an der Hämatopoese, der Produktion von Antikörpern und dem Antigenabbauprozess während der Immunantwortaktivitäten für die Verwendung von Leber und Milz in unserer Studie33,34.

Basierend auf unseren vorherigen Ergebnissen weisen Zackenbarsche, die mit der Nahrung Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure und Behensäure gefüttert werden, höhere Überlebensraten im Vergleich zu Zackenbarschen auf, die mit den Kontrollnahrungsmitteln gefüttert werden, um eine Vibrio-Infektion zu verhindern22. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit einer Studie über Ölsäure als entzündungshemmendes Mittel, das eine Rolle bei der Aktivierung verschiedener immunkompetenter Zellwege spielt35 und für die Modulation von Wundentzündungen durch die Induktion der Wundheilung verantwortlich ist36. In unserer Studie fungieren andere Zutaten wie Fischmehl und Sojamehl als Proteinquellen, während Pflanzenöl die Lipidquelle ist. Eine Studie von Faudzi et al.37 ergab, dass die Sojamehlkonzentration in der täglichen Futteraufnahme von Hybrid-Zackenbarschen 50 % der gesamten Futterformulierung erreichen könnte, ohne das Wachstum oder die Körperkondition von Hybrid-Zackenbarschen wesentlich zu beeinträchtigen. Die in der Studie verwendeten Kohlenhydrate, wie zum Beispiel Maismehl, sind eine Energiequelle und können zur Bindungsaktivität in der Futtermittelproduktion genutzt werden. Vitamine und Mineralien sind organische und anorganische Verbindungen, die für das normale Wachstum und die Entwicklung der Körperfunktionen von Fischen notwendig sind27. Aufgrund der vollständigen und optimalen Nahrungsbestandteile, einschließlich Proteinen, Kohlenhydraten, Lipiden, Vitaminen und Mineralstoffen in allen Nahrungsgruppen, waren die Metabolomveränderungen beim Zackenbarsch nicht auf diese Bestandteile zurückzuführen, sondern auf die Zugabe verschiedener verwendeter Fettsäuren, die als solche wirken ein Immunstimulans zur Steigerung der Immunantwort der Fische.

Die Ergänzung von Fettsäureverbindungen im Allgemeinen und klinisch wurde in vielen verschiedenen Tiermodellen und Gewebekulturen untersucht. Bei Fischen konzentrierten sich mehrere Studien hauptsächlich auf die Verbesserung der Fischgesundheit, insbesondere auf die Untersuchung der Wirkung der spezifischen Verbindung auf Krankheitsresistenzen und die Stärkung der Immunität29,38,39. Beispielsweise konzentriert sich eine Studie von Ebrahimi et al.29 auf die Verwendung organischer Säuren für das Wachstum des roten Hybridtilapia, eine Studie von Nayak et al.38 konzentriert sich auf die Verwendung von Docosahexaensäure und Eicosapentaensäure (DHA/EPA) für das Wachstum und Immunantwort von Golden Pompano, während sich eine Studie von Zhang et al.39 auf die Verwendung von ω6 LC-PUFA-reichen Algen konzentriert, um die Immunantwort von Zebrafischen auf Streptokokkeninfektionen zu verbessern. In einer anderen früheren Studie wurde festgestellt, dass eine große Menge an Omega-9-Fettsäuren wie Ölsäure, Palmitoleinsäure, 6,9-Octadecensäure, 8,11-Eicosadiensäure und cis-Erucasäure eine große Rolle dabei spielen die Immunantwort des Zackenbarsches nach einer Vibrio-Infektion. Darüber hinaus weisen auch andere Fettsäuren aus der Gruppe der ungesättigten Fettsäuren, darunter Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachinsäure, Behensäure und Lignocerinsäure, nach einer Vibrio-Infektion eine hohe Metabolitenintensität auf21. Daher wurden in unserer Studie Ölsäure, Stearinsäure, Behensäure und Palmitinsäure als Futterimmunstimulanzien verwendet, um die Immunantwort des Zackenbarsches auf eine Vibriose-Infektion zu stimulieren. Das Kontrollfutter wurde ohne Zusatz von Fettsäure zubereitet. Vier verschiedene Fettsäuren wurden nicht nur aufgrund ihrer positiven Ergebnisse in verschiedenen Wasserlebewesen20,22,40,41,42 ausgewählt, sondern auch aufgrund ihrer Erschwinglichkeit als Fischfutterzutat, die die Produktionskosten für Fischfutter senken könnte.

Der metabolomische Ansatz bietet enorme potenzielle Erkenntnisse in der Aquakulturindustrie, nicht nur für die Identifizierung von Biomarkern und die Krankheitsdiagnose, sondern trägt auch zum Verständnis der biochemischen Wege bei, die an den immunologischen Reaktionen der Fische beteiligt sind23,43. In unserer aktuellen Studie wurde eine GC-MS-Analyse an Leber- und Milzproben von überlebenden infizierten Zackenbarschen durchgeführt, die mit fünf unterschiedlich formulierten Diäten gefüttert wurden. Nach sechswöchigem Fütterungsversuch und einer Woche postbakterieller Belastung zeigten die Leberproben des überlebenden infizierten Zackenbarsches, der mit einer mit Ölsäure formulierten Diät gefüttert wurde, einen höheren Nachweis von Metabolitenverbindungen im Vergleich zu den anderen mit Fisch formulierten Diäten (Abb. 3). Die in der Ölsäuregruppe identifizierten höheren Metaboliten könnten darauf hindeuten, dass Zackenbarsche mehr Metaboliten benötigten und regulierten, um ihren Körper vor dem Eindringen von Krankheitserregern zu schützen44. In der aktuellen Studie könnten die Metabolitenveränderungen beim überlebten infizierten Zackenbarsch aus unterschiedlichen Futterformulierungsgruppen auf die Wirkung des Krankheitserregers zurückzuführen sein, die Stoffwechselaktivitäten des Zackenbarsches bei der Abwehr von Invasionen zu verändern45. Darüber hinaus könnten die geringeren Metaboliten, die in der Milz nachgewiesen wurden, auf die winzige Größe der Milz im Vergleich zur Leber zurückzuführen sein, wo sie weniger Metaboliten produzierte, da sich die Milz möglicherweise zu verschlechtern begann und nicht mehr voll funktionsfähig sein könnte, nachdem Vibrio das Innere des Organismus angegriffen hatte Organe46.

Aus Abb. 3 geht hervor, dass in der Leber von Zackenbarschen, die mit Ölsäure gefüttert wurden, vermehrt Metaboliten aus der Aminosäuregruppe produziert wurden. In der Milz wurden jedoch in der Kontrollgruppe höhere Aminosäuremetaboliten beobachtet. Frühere Untersuchungen ergaben, dass die Aminosäuren eine wichtige Rolle im Fischstoffwechsel spielen, insbesondere bei der Umwandlung von Fischnahrungsproteinen in Fischprotein, wo eine hohe Regulierung der Aminosäuren erforderlich ist, um die Rolle im Energiestoffwechsel einschließlich der Gluconeogenese (Produktion von Glukose aus Nicht-Kohlenhydraten) wesentlich zu beeinflussen Kohlenstoffsubstrate), Lipogenese (Umwandlung von Fettsäuren und Glycerin in Fette) und Oxidationssubstrate in Fischen47. Wie in der Ergänzungstabelle 2 gezeigt, wurde die hohe Häufigkeit an Aminosäuren hauptsächlich in der Leberprobe von überlebten infizierten Zackenbarschen gefunden, die mit einer Ölsäurediät gefüttert wurden. Diese Aminosäuren bestehen aus L-Valin (1,8 %), L-Glutamin (1,8 %), N-α-Acetyl-L-Lysin (1,7 %), L-Threonin (0,9 %) und L-Leucin (0,7 %). ). Unterdessen wurde in der Leber von überlebenden infizierten Zackenbarschen, die mit der Kontrolldiät gefüttert wurden, Glycin (13,7 %) als die höchste Aminosäurehäufigkeit im Vergleich zur Ölsäurediät (7,9 %) identifiziert. Im Vergleich dazu weisen die Milzproben die höchste Häufigkeit an Aminosäuren auf, darunter Glycin (20,9 %), L-Alanin (3,2 %) und L-Leucin (0,6 %), bei dem Zackenbarsch, der mit einer Ölsäure-Diät gefüttert wurde. In der Zwischenzeit. Bei Zackenbarsch, der mit einer Kontrolldiät gefüttert wurde, wurden in den Milzproben große Mengen an L-Glutamin (6,4 %), L-Asparaginsäure (3,6 %) und L-Serin (1,4 %) gefunden. Diese prozentualen Flächenunterschiede zwischen den Futtern könnten auf unterschiedliche Reaktionen der einzelnen Futtergruppen auf den Stoffwechselmechanismus der Immunantwort der Fische auf eine Vibrio-Infektion nach sechs Wochen zurückzuführen sein. Die prozentualen Flächenunterschiede zwischen den Futtergruppen korrelierten nicht mit der Anzahl der in jeder Futtergruppe produzierten Metaboliten, sondern spiegelten stattdessen die Intensität bzw. die Auf- und Abregulierung der produzierten Metaboliten für jede Futtergruppe wider48.

Wenn man sich Abb. 5 ansieht, können die meisten der höheren einzigartigen Metaboliten in Leberproben von überlebenden infizierten Zackenbarschen beobachtet werden, die mit Ölsäure, Palmitinsäure, Behensäure und Stearinsäure gefüttert wurden. Wenn wir jedoch Leber- und Milzproben von überlebenden infizierten Zackenbarschen vergleichen, die mit Kontrolldiät gefüttert wurden, sind einzigartige Metaboliten in der Milz viel häufiger anzutreffen (acht Metaboliten) als in der Leber (ein Metabolit). Dieser Zustand kann darauf zurückzuführen sein, dass Zackenbarsche mehr Metaboliten freisetzen müssen, um der Invasion von Krankheitserregern zu widerstehen und gleichzeitig ihr Überleben aufrechtzuerhalten, da ihrer Futterformulierung in der Kontrolldiät kein Immunstimulans zugesetzt wurde. Die einzigartigen Metaboliten fungieren dann als Signalmoleküle, die die Abwehrmechanismen der Fische anregen.

Von diesen Aminosäuren, nämlich L-Leucin, -Valin und L-Alanin, wurde bereits nachgewiesen, dass sie maßgeblich an der Immunantwort mehrerer Fischarten beteiligt sind, darunter der Tilapia Oreochromis niloticus gegen Streptococcus iniae49 und der Zebrafisch Danio rerio gegen V. alginolyticus50 und Atlantischer Lachs gegen Aeromonas salmonicida-Infektion51. Bei Tilapia hilft das Vorhandensein von exogenem L-Leucin dabei, sein Metabolom zu modulieren, um die angeborene Immunität während einer S. iniae-Infektion zu stärken49. Unterdessen gehörten bei Zebrafischen, die von V. alginolyticus betroffen waren, Valin und Leucin zu den verschiedenen Metaboliten, die zwischen überlebenden und sterbenden Gruppen identifiziert wurden, was darauf hindeutet, dass diese Metaboliten am Überleben der Fische beteiligt sind50. Es wurde festgestellt, dass L-Alanin eine Funktion bei der Hemmung der Apoptose und der Stimulierung der Proliferation von Lymphozyten des Atlantischen Lachses während einer Infektion mit dem Bakterium A. salmonicida hat51. In einer anderen Studie zeigten Leucin, Isoleucin, Valin und Threonin als Reaktion auf eine V. vulnificus-Infektion eine hohe Metabolitenhäufigkeit im Gewebemuskel des Braunmarmor-Zackenbarsches45. Untersuchungen haben ergeben, dass L-Valin die Phagozytose der Makrophagen fördert und so das Bakterienwachstum hemmt52. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass Aminosäuren wie Glutamin ein wichtiges Substrat in sich schnell teilenden Zellen, einschließlich Lymphozyten und Enterozyten, sind und gleichzeitig Energie für andere interzelluläre Transporte, Gewebewachstum und Zellmigration produzieren53. Darüber hinaus führte Glutamin zu einer deutlichen Steigerung der Funktion der Erythrozyten, die bekanntermaßen eine wesentliche Rolle beim Transport von Sauerstoff und Kohlendioxid während der Fischatmung spielen54. Die Effizienz des Sauerstoff- und Kohlendioxidtransports im Fischstoffwechsel ist auch während des TCA-Zyklus besonders wichtig, wo Glutamin in α-Ketoglutarat umgewandelt wird und zusätzliche Energie für die Aktivierung der Immunantwort der Fische bereitstellt55. Es wurde festgestellt, dass Glycin die Immunantwort von Nilbarschen, die mit S. iniae infiziert sind, stimuliert, indem es die Myeloperoxidase-Aktivität erhöht, die eine Reihe reaktiver Oxidationsspezies (ROS) produziert, die eine wichtige Komponente der angeborenen Immunantwort darstellen56. Inzwischen wurde festgestellt, dass die Überproduktion von ROS während der frühen Infektion bei Fischen durch die Anwesenheit von Serin aufrechterhalten werden kann, das dabei hilft, die ROS-Produktion herunterzuregulieren, die eine Rolle bei der Aktivierung von Inflammasom und Interleukin-1β im Makrophagen spielt57. Laut Wu44 sind die Anforderungen an Aminosäuren als Schlüsselstoffwechselweg zur Erzielung der gewünschten Effizienz der Stoffwechselumwandlung wichtig für das Wachstum und die Aufrechterhaltung des Überlebens der Organismen bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten. Der hohe Aminosäuregehalt im aktuellen Ergebnis stimmt mit dem früheren Befund von Yang et al.58 überein, bei dem sie erfolgreich einen höheren Prozentsatz an Aminosäuren im überlebenden infizierten Zebrafisch D. rerio gegen eine V. alginolyticus-Infektion im Vergleich zu anderen profilieren konnten Metabolitengruppen.

Kohlenhydrate sind ein notwendiger Bestandteil der Fischernährung, der das gesamte Körpergewebe und die Organe mit Energie versorgt. Bei Fischen ist eine konstante Energieversorgung erforderlich, insbesondere wenn Fische während einer Infektion mit Krankheitserregern unter Stress leiden. Diese Energie wird durch den Glykolyseprozess erzeugt, bei dem Glykogen in Glukose umgewandelt und zur Aktivierung der Immunmechanismen verwendet wird59. Die Glykolyse findet hauptsächlich in der Leber statt, wo die Ansammlung von Kohlenhydraten in Form von Glykogen erfolgt60. In dieser Studie konnte die höchste Häufigkeit an Kohlenhydratmetaboliten in den Leberproben von Zackenbarschen gefunden werden, die mit einer mit Behensäure formulierten Diät gefüttert wurden, nämlich D-Galactose (58,2 %) und D-Glucose (11,0 %). Den niedrigsten Anteil an D-Galactose (41,5 %) und D-Glucose (7,5 %) finden sich hingegen in den Leberproben von Zackenbarschen, die mit einer Ölsäure-Diät gefüttert wurden. (Ergänzungstabelle 1). Wie in der Milz waren Kohlenhydrate wie D-Glucose (10,2 %), D-Ribose (3,7 %), Thymol-α-d-glucopyranosid (8,3 %) und α-d-Galactopyranosiduronsäure (11,6 %) reichlich vorhanden bei Zackenbarschen, die mit Ölsäure gefüttert werden. Unterdessen wurde bei Zackenbarschen, die mit stearinsäurehaltigem Futter gefüttert wurden, beobachtet, dass D-Galactose (45,9 %) und D-Mannose (4,7 %) im Vergleich zu den anderen Fischfuttergruppen den höchsten Anteil an Kohlenhydratmetaboliten aufwiesen. Die Ergebnisse stimmten mit früheren Berichten überein, wonach Metaboliten wie D-Galactose, D-Glucose, D-Ribose45 und Mannose61 an der Stärkung der Immunmechanismen der Fische beteiligt waren. Der hohe Glukosegehalt in den Leber- und Milzproben weist darauf hin, dass Fische durch Glykolyse notwendige Kohlenhydratbestandteile aus ihrer Nahrung in Glukose umgewandelt haben, um den Energiebedarf zu decken, und dadurch Immunmechanismen der Fische in Gang gesetzt haben, die es den Fischen ermöglichen, Infektionskrankheiten zu widerstehen60. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass Glukose eine wichtige Rolle bei der Verstärkung der Immunantwort von Tilapia-Fischen gegen eine E. tarda-Infektion spielt62. Laut Al-Banaw et al.61 wird Mannose in großen Mengen im Schleim von Welsen, Arius tenuispinis, zusammen mit anderen Kohlenhydratzusammensetzungen, einschließlich N-Acetylgalactosamin und N-Acetylglucosamin, produziert. Es ist bekannt, dass der Schleim, der antibakterielle Enzyme und angeborene Immunitäts-ähnliche Proteine ​​enthält, auf der Fischhautoberfläche eine wichtige Komponente bei der Bereitstellung einer physikalischen und chemischen Barriere gegen das Eindringen von Krankheitserregern darstellt63. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass D-Galaktose und Mannose reichlich im Hautschleim der Dorade, Sparus aurata, vorkommen und zahlreiche Immunkomponenten enthalten. In diesem Zusammenhang hemmten Galactose und Mannose die bakterielle Adhäsion an der Kieme während einer V. alginolyticus-Infektion erheblich64. In einer anderen Studie wurde erwähnt, dass D-Ribose ein wichtiger Bestandteil vieler Strukturen des Immunsystems ist. Beispielsweise wird Ribose in Kombination mit Guanin oder Thymin in Ribofuranosyl umgewandelt, das als immunreaktionsverstärkendes Mittel bekannt ist, das die Fähigkeit des Sir2p-Proteins (Silent Information Regulator Protein) verbessert, angesichts der Entwicklung überlegener reaktiver Sauerstoffspezies gegen Krankheitserregerinfektionen65, 66,67.

Unter den Futtergruppen wurde bei den mit Ölsäure gefütterten Zackenbarschen ein hoher Fettsäuregehalt in den Proben beobachtet. Drei Metaboliten aus der Fettsäuregruppe, bestehend aus Ölsäure (1,5 %), trans-13-Octadecensäure (1,4 %) und Hexadecensäure (1,3 %), wurden in großer Menge in der Leber von Zackenbarschen nachgewiesen, die mit Ölsäure gefüttert wurden (Ergänzungstabelle 1). ). Obwohl in der aktuellen Studie nicht viele Metaboliten aus der Fettsäuregruppe identifiziert wurden, stellte die Ergänzung von Fettsäuren wie Ölsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure und Behensäure in der Fischfutterformulierung einen wichtigen Ernährungsbestandteil für die Fische dar , nicht nur zur Aufrechterhaltung ihrer strukturellen Zellmembranen, sondern auch für umfangreiche Stoffwechselprozesse und Vorläufer von Signalmolekülen im Fischkörper68,69. Darüber hinaus zeigte die Überlebensrate von Zackenbarschen, die mit diesen Fettsäurediäten gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrollfutterdiät einen Anstieg. Unter diesen Fettsäurediäten steigerte Ölsäure nachweislich die stärksten Immunreaktionen, einschließlich Lysozymaktivität, Respiratory-Burst-Aktivität und Phagozytoseaktivität, bei mit V. vulnificus infizierten Hybrid-Zackenbarschen22. Laut Özogul & Özogul70 ist Ölsäure eine einfach ungesättigte Fettsäure (MUFA) aus der Gruppe der Omega-9-Fettsäuren, die Prostaglandin synthetisieren könnte, um die Wundheilung anzuregen. In einer früheren Studie spielte Ölsäure eine Rolle als entzündungshemmende Komponente, die verschiedene Wege immunkompetenter Zellen aktivierte71. Darüber hinaus zeigte in einer anderen Studie der große Gelbe Krähenfisch, Larimichthys polyactis, der mit einer mit Olivenöl formulierten Nahrung gefüttert wurde, die eine Zusammensetzung mit hohem Ölsäuregehalt enthielt, eine zunehmende entzündungsfördernde Genexpression und eine zunehmende Aktivität für andere immunbezogene Proteine ​​und Enzyme, wie z als Tumornekrosefaktor-α (TNFα), Interleukin-1β (IL-1β) und Cyclooxygenase-2 (COX-2)40. Daher stützte der Befund unsere Ergebnisse, wonach eine Nahrungsergänzung mit Fettsäuren wie Ölsäure dem Zackenbarsch helfen könnte, sein Überleben aufrechtzuerhalten und die Immunität zu erhöhen, indem er während der Aufnahme von Krankheitserregern eine gewünschte Stoffwechselumwandlung herbeiführt. Laut Fadjar et al.72 kann Ölsäure mit den Bakterienmembranen reagieren, wobei die Ölsäureverbindung die Lipoglycopeptide oder Glycodepsipeptide einer Zellwand aufbrechen und gleichzeitig die Bakterien abtöten könnte, was die Sterblichkeitsrate senkt. In der aktuellen Studie stimmte eine Fülle von Hexadecensäure in der Leber des mit Ölsäure gefütterten Zackenbarsches mit dem Ergebnis eines früheren Berichts überein, in dem festgestellt wurde, dass Hexadecensäure eine entzündungshemmende Wirkung entfaltet, die mit anderen Omega-Fettsäuren vergleichbar ist -3 Fettsäuren73.

Die SIMCA-P + -, PCA- und PLS-DA-Analysen wurden durchgeführt, um die Verteilung der im überlebenden infizierten Zackenbarsch nachgewiesenen Metabolitenverbindungen zu analysieren. Wie in Abb. 6b gezeigt, deutete eine gute Clustertrennung zwischen Leber- und Milzproben darauf hin, dass Metaboliten als Reaktion auf eine Vibrio-Infektion ausschließlich zwischen Leber- und Milzproben produziert werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Futterformulierungen wurden fünf unterschiedliche Cluster-Diskriminierungsmuster zwischen den fünf Futtergruppen beobachtet, nämlich Ölsäure, Stearinsäure, Behensäure, Palmitinsäure und Kontrolle in den Leber- und Milzproben (Abb. 7b bzw. 8b). Die Ergebnisse zeigten, dass die Leber- und Milzproben von überlebenden infizierten Zackenbarschen, die mit Ölsäure über die Nahrung gefüttert wurden, aufgrund ihrer unterschiedlichen Metaboliten die größten Auswirkungen hatten, da die Ölsäuregruppe weiter von den Kontrollnahrungsgruppen entfernt lag. Während es stimmt, dass Proben, die ähnliche Metaboliten produzieren, auf natürliche Weise Cluster bilden und Proben, die unterschiedliche Metaboliten produzieren, weiter verteilt sind, ist es auch wichtig zu beachten, dass Konzentration und Probengröße ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Bestimmung des Clustermusters spielen74.

Abbildung 12 zeigt die Anreicherungswege der Leber- und Milzproben des überlebten infizierten Zackenbarsches. In unserer Studie wurden das Stoffwechselprofil sowie die Stoffwechselwege untersucht, um die gemeinsamen Metaboliten und Stoffwechselwege aus fünf unterschiedlich formulierten Diäten zu untersuchen. Tatsächlich wurde in früheren Studien berichtet, dass der Nachweis von Metaboliten und der Aufbau von Signalwegen an den Mechanismen der Immunantwort beteiligt sind75,76,77. Unter den signifikanten (p < 0,05) Stoffwechselwegen, die in Tabelle 2 aufgeführt sind, haben wir zwei Aminosäurestoffwechselwege mit den höchsten Einflusswerten identifiziert, darunter den Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel (Auswirkung = 0,35) für die Leber und den Glycin-, Serin- und Threoninstoffwechsel (Auswirkung = 0,49) für Milzorgane, was darauf hindeutet, dass diese Aminosäurewege eine Rolle für das Überleben von Fischen während einer V. vulnificus-Infektion spielen.

Obwohl wir in Tabelle 2 beobachten können, dass der Glycin-, Serin- und Threonin-Stoffwechselweg in der Leber und die Phenylalanin-, Tyrosin- und Tryptophan-Biosynthese in der Milz höhere Einflusswerte von 0,49 bzw. 0,50 zeigten, da es jedoch keinen angereicherten signifikanten Unterschied gab (S > 0,05) zwischen ihren unterschiedlichen Metaboliten haben wir festgestellt, dass sie keinen Einfluss auf die Immunantwort der Fische hatten, da es wichtig ist, dass der p-Wert bei p < 0,05 und der Impact-Wert bei 0,1 > 1,0 liegen muss. Unsere Ergebnisse stimmen mit den Ergebnissen von Baharum et al.78 und Yang et al.79 überein. In einer Studie von Baharum et al.78 wurde gezeigt, dass der Alanin-, Aspartat- und Glutamatstoffwechsel einer der entscheidenden Stoffwechselwege ist, die eine schützende Rolle bei der Steigerung der ATP-Produktion spielen, wenn man bedenkt, dass L-Glutamin in den TCA-Zyklus eintreten und Energie zum Fahren liefern kann die Abwehrmechanismen gegen Infektionskrankheiten50. Inzwischen haben Yang et al.79 berichtet, dass der Glycin-, Serin- und Threonin-Metabolismus der am stärksten betroffene Stoffwechselweg ist, der die Immunantwort von Niltilapia, O. niloticus, nach einer Infektion mit E. tarda verstärkt. Hier wurde berichtet, dass der Serin-Metabolit, der aus der Kopfnierenprobe von Niltilapia identifiziert wurde, unter den anderen identifizierten Metaboliten die höchste Metabolitenhäufigkeit aufwies. Dies steht im Einklang mit einer früheren Studie80, in der Serin die Produktion von Interleukin 1β (IL-1β) in Makrophagen fördert und als Schlüsselmediator für die Entzündungsreaktion fungiert, die für die Aktivierung der Immunantwort der Fische auf die Invasion von Krankheitserregern von entscheidender Bedeutung ist. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Serin die Homöostase aufrechterhalten kann, indem es die ROS-Produktion ausgleicht, wobei anhaltend hohe ROS-Spiegel zu einer Hyperaktivierung der Immunantwort und damit zu Gewebeschäden führen können79,81.

Im Einklang mit unserer früheren Erkenntnis, dass eine Ölsäure-Diät die Immunantwort des Zackenbarsches effektiv steigert22, zeigen unsere aktuellen Ergebnisse, dass die Metaboliten L-Glutamin und L-Asparaginsäure, die zu den am stärksten betroffenen Stoffwechselwegen von Alanin, Aspartat und Glutamat gehören, stark betroffen sind in den Leberproben von Zackenbarschen, die mit der Ölsäure-Diät gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolldiätgruppe reichlich vorhanden (Abb. 12). Unterdessen waren L-Serin-, Glycin- und L-Threonin-Metaboliten, die zu den am stärksten betroffenen Stoffwechselwegen von Glycin, Serin und Threonin gehören, in den Milzproben von Zackenbarschen, die mit Ölsäure gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolldiätgruppe sehr häufig anzutreffen (Abb. 12). Dieser Befund hat gezeigt, dass die Rolle von Metaboliten wie L-Glutamin, L-Asparaginsäure, L-Serin, Glycin und L-Threonin bei der Regulierung der Stoffwechselwege die Immunantwort von Zackenbarschen, die mit einer Ölsäure-Diät gegen V gefüttert werden, verstärken kann . Vulnificus-Infektion. Eine ähnliche Studie ergab, dass im überlebenden, mit V. vulnificus infizierten Zackenbarsch ein hoher Gehalt an Aminosäuren, einschließlich Threonin, Glutamin und Asparaginsäure, gefunden wurde45,78.

In dieser Arbeit wurde ein GC-MS-basierter Analyseansatz verwendet, um die Metabolomveränderungen in der Leber und den Milzproben überlebender infizierter Zackenbarsche zu charakterisieren, die mit fünf verschiedenen Arten von Diätformulierungen gefüttert wurden. Die Metabolomveränderungen des überlebten infizierten Zackenbarsches waren auf die Reaktion des Zackenbarsches auf eine Vibrio-Infektion in Abhängigkeit von der Fettsäureaufnahme in der Nahrung zurückzuführen und nicht auf die in der Diskussion erwähnte Unterernährung. Basierend auf der von PLS-DA abgeleiteten Analyse deutet die Clusterbildung der Metaboliten zwischen Zackenbarschen, die mit der Ölsäure-Diät gefüttert wurden, und Zackenbarschen, die mit der Kontrolldiät gefüttert wurden, darauf hin, dass die Ölsäure-Diät einen Einfluss auf die Aktivierung der Immunantwort des Zackenbarsches nach einer Vibrio-Infektion hat. Die Ölsäure-Diät erhöhte den Alanin-, Aspartat- und Glutamat-Stoffwechselweg sowie die Häufigkeit der Metaboliten L-Glutamin (1,8 %) und L-Asparaginsäure (0,6 %). Diese Aminosäuren wurden in der Leber von Zackenbarschen, die mit der Ölsäure-Diät gefüttert wurden, im Vergleich zur Kontrolldiät in großer Häufigkeit nachgewiesen. Unterdessen waren in der Milz die Stoffwechselwege von Glycin, Serin und Threonin erhöht, entsprechend der hohen Häufigkeit von Glycin (20,9 %), L-Threonin (1,0 %) und L-Serin (0,8 %) bei mit diesem Futter gefütterten Zackenbarschen Ölsäurediät im Vergleich zur Kontrolldiät. Daher schlagen wir diese Stoffwechselmodulation als einen vielversprechenden Ansatz zur Modifizierung der Immunantwortmechanismen des Zackenbarsches vor, der ein großes Potenzial zur Aktivierung der Immunantwort und zur Erhöhung des Überlebens des Zackenbarsches bietet.

Das Experiment wurde in den Versuchsanlagen der Hatchery Unit, Institute of Bioscience, Universiti Putra Malaysia durchgeführt. Alle Experimente wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, die vom Tierethischen Komitee der Universität Kebangsaan Malaysia (UKMAEC) genehmigt wurden (Referenznummer: IBC/Ack/2/2019). Die Berichterstattung im Manuskript folgt den Empfehlungen in den ARRIVE-Richtlinien. Zweihundertfünfzig Zackenbarsche mit einer Länge und einem Gewicht von etwa 3,0–4,0 Zoll bzw. 11,5 ± 0,5 g wurden von der örtlichen Brutfarm Pantai Dasar Sabak, Kota Bahru, Kelantan, bezogen. Der Zackenbarsch wurde eine Woche lang in einem 1000-l-Glasfasertank akklimatisiert, der mit gefiltertem Meerwasser gefüllt und mit einem Wasserfilterpumpensystem und Belüftung ausgestattet war. Die Wasserqualität wurde während der Akklimatisierungsphase mit dem YSI Multiprobe System bei einer Temperatur von 28,0 ± 1 °C, einem pH-Wert von etwa 8,0 ± 1, einem Salzgehalt von etwa 30 ± 1 ppt und einem gelösten Sauerstoff (DO) im Bereich zwischen 5,5 und 6,0 ​​mg/L aufrechterhalten. Nach der anfänglichen Akklimatisierungsphase wurden die 225 Zackenbarsche dann gleichmäßig auf 15 Glasaquarien verteilt (3n = 15 Fische/60 × 60 × 40 cm große Glasaquarien), in denen jedes mit etwa 80 l gefiltertem Meerwasser gefüllt war. Jede Diätgruppe wurde in drei Wiederholungen dargestellt (Abb. 13).

Diagramm der Einrichtung eines Aquarienbeckens für fünf verschiedene Futterformulierungen.

Eine weitere Akklimatisierung erfolgte fünf Tage lang, bevor dem Zackenbarsch eine spezifische Futterergänzung verabreicht wurde. Fünf verschiedene Diätformulierungen wurden basierend auf der Futterformulierung von Natnan et al.22 hergestellt (Tabelle 3). Die Futterformulierung des Zackenbarsches umfasste die Ergänzung von Ölsäure, Stearinsäure, Behensäure und Palmitinsäure in jedem der formulierten Futterpräparate, während das Kontrollfutter ohne Zusatz von Fettsäuren auskam. Der Zackenbarsch wurde sechs Wochen lang täglich um 9.00 und 16.00 Uhr gefüttert. Während des Fütterungsexperiments wurde jedes Glasaquarium belüftet, während die Wasserqualitätsparameter bei 28,0 ± 1 °C, der Salzgehalt bei 30 ± 1 (ppt), der pH-Wert bei 8,0 ± 1 und der Sauerstoffgehalt im Bereich zwischen 5,5 und 6,0 ​​mg/ gehalten wurden. L mit YSI Multiprobe System. Der Wasseraustausch erfolgte alle zwei Tage, wobei etwa 50 % des Gesamtvolumens ausgetauscht wurden.

V. vulnificus wurde aus dem Glycerinstamm von infizierten Zackenbarschen wiederbelebt21. Die Identifizierung von Bakterienstämmen wurde wie in einer früheren Studie von Natnan et al.22 durchgeführt. Eine einzelne Kolonie von V. vulnificus wurde aus einer Thiosulfat-Citrat-Gallensalz-Saccharose-Platte (TCBS) entnommen und über Nacht in tryptischer Sojabrühe (TSB) bei 30 °C für 18–24 Stunden kultiviert. Anschließend wurde die Bakterienkultur mittels Spektrometrie mit frischem TSB-Medium auf eine Konzentration von 5,4 × 107 KBE/ml eingestellt. Nach sechs Wochen des Fütterungsexperiments wurden alle Zackenbarsche, die mit verschiedenen Fettsäurediäten gefüttert wurden, einschließlich der Kontrollgruppe, mit einer mittleren tödlichen Dosis (LD50) von V. vulnificus (5,4 × 107 KBE/ml) infiziert22. Nach 30-minütigem Eintauchen in V. vulnificus wurden die Zackenbarschjunglinge zurück in ihre perfekten Glasaquarien mit sauberem Meerwasser überführt21. Während dieser 30-minütigen Dauerexposition können sich Bakterien auf der Haut und den Kiemen der Fische festsetzen, während einige sogar in die Organe der Fische eindringen konnten. Das Fütterungsregime wurde für eine weitere Woche fortgesetzt. Nach einer Woche postbakterieller Belastung wurde die Haut des toten Fisches abgewischt und die Proben auf den TCBS-Agarplatten ausgestrichen, um das Vorhandensein von Vibrio zu überprüfen. Die Platten wurden 18 – 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Nach einer Woche postbakterieller Belastung wurden die überlebenden Zackenbarsche aus allen fünf verschiedenen Futterrationen für eine spätere GC-MS-Analyse ausgewählt.

Nach einer Woche der postbakteriellen Belastung wurden die überlebenden infizierten Zackenbarsche getötet, bevor die Leberproben entnommen und einzeln gewogen wurden. Die Durchschnittsgewichte der gepoolten Leberproben lagen zwischen 0,2 und 0,45 g und der Milzproben zwischen 0,02 und 0,04 g. Anschließend wurden die Proben von vier überlebenden Zackenbarschen in jedem Glasaquarium gepoolt, um ein biologisches Replikat darzustellen. Um den Mindestvolumenbedarf für die Metabolitenextraktion sicherzustellen, wurden die Leberproben aus denselben Glasaquarien zusammengefasst. Der gleiche Erntevorgang wurde für die Milzproben durchgeführt. Insgesamt wurden vier biologische Individuen für jeweils fünf verschiedene Fütterungsgruppen mit drei technischen Replikaten vorbereitet. Alle Proben wurden am Morgen gesammelt.

Die gepoolten Proben wurden schnell mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und vor der Metabolitenextraktion bei –80 °C gelagert. Die gepoolten Organe wurden für jede Wiederholung separat mit flüssigem Stickstoff gemahlen. Die pulverisierte Probe wurde dann einer Metabolitenextraktion unterzogen, die von Mayalvanan82 und Wu et al.83 mit Modifikation übernommen wurde. Die mit flüssigem Stickstoff gemahlene Probe wurde mit einem Endverhältnis von 2,0:2,0:1,8 Lösungsmitteln (Methanol:Chloroform:Wasser) gemischt. Während der Metabolitenextraktion werden die Lösungsmittel und Proben kalt gehalten, um eine Zersetzung zu verhindern. Der gemahlenen Probe wurden die zuvor erwähnten 4 ml/g kaltes Methanol und 1,6 ml/g kaltes Wasser zugesetzt, bevor sie verwirbelt wurde. Dann wurden der Mischung 2 ml/g kaltes Chloroform zugesetzt und verrührt. Die Mischung wurde 40 Minuten lang in Eis inkubiert und anschließend 10 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 U/min zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mit 2 ml/g kaltem Chloroform und 2 ml/g kaltem Wasser versetzt, bevor die Mischung erneut 20 Minuten lang bei 4 °C und 10.000 U/min zentrifugiert wurde. Die obere zweiphasige Schicht wurde dann in das neue Fläschchen überführt und vor der GC-MS-Analyse bei –80 °C gelagert. Die Schritte wurden für alle entnommenen Organe wiederholt.

Die TMS-Derivatisierungsmethode basierte auf der Methode von Roessner et al.84 und Azizan et al.85 mit Modifikationen. Die Zugabe von 2 µl internem Standard (0,2 µmol von 10 mmol Lösungen von 2,3,3,3-d4 D, L-Alanin) zu jeder 100 µl-Probe der Metabolitenextraktion erfolgte. Der Überstand wurde in einem Vakuumkonzentrator getrocknet, bevor die Probe in Methoxyaminhydrochlorid (MeOX)-Lösung in Pyridin (50 µL, 2 g/100 ml) resuspendiert wurde. Die Mischung wurde dann 90 Minuten lang bei 40 °C inkubiert. N-Methyl-N-(trimethylsilyl)-trifluoracetamid (MSTFA) wurde zugegeben (ungefähr 50 µL), gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 40 °C. Die letzte Inkubationsprobe wurde dann zur GC-MS-Analyse in ein neues GC-MS-Fläschchen überführt.

Die GC-MS-Analyse wurde basierend auf der Methode von Nurdalila et al.45 und Azizan et al.85 mit einigen Modifikationen durchgeführt. Für die Probenanalyse wurde das GC-MS Turbo Mass Clarus 600 von Perkin Elmer verwendet, gekoppelt an eine bei 70 eV betriebene Elektronenionisation (EI) mit einem massenselektiven Detektor. Ein Aliquot von etwa 1,0 μl Probe wurde in eine Elite-5 MS-Kapillarsäule (0,25 μm Dicke × 30,0 m × 0,25 mm Innendurchmesser) injiziert, die im Split-Modus mit Dimethylpolysiloxan (95 %) und vernetztem Diphenyl (5 %) beschichtet war 50:1. Die Injektionstemperatur wurde auf 250 °C eingestellt, während die Temperatur der Ionenquelle auf 200 °C eingestellt wurde. Bei GC-Temperaturen zwischen 70 °C und 300 °C wurde ein kontinuierlicher Heliumgasstrom mit einer Geschwindigkeit von 1,1 ml pro Minute zugeführt. Als aufgenommene Spektren wurde der Vollscanmodus mit m/z 45–600 verwendet.

Die Rohdaten aus dem Net-CDF-Format (Network Common Data Form) wurden für die GC-MS-Analyse konvertiert. Die GC-MS-Datentabelle mit Retentionszeit, Metabolitenname, Peakfläche, Übereinstimmung und der relativen Übereinstimmung wurde mit der TurboMass™ GC-MS-Software (Perkin Elmer, USA) erstellt. Die Identifizierung der Metaboliten erfolgte mithilfe der Massenspektrendatenbankbibliothek des NIST (National Institute of Standards and Technology) (NIST 2008) mit einem Übereinstimmungsgrenzwert von 800 aus den Daten verworfenen Werten. Der interne Standard und alle anderen den Lösungsmitteln entsprechenden Metaboliten wurden vor der multivariaten Analyse ausgeschlossen. Der Wert der Peakfläche wurde zur Darstellung der nachgewiesenen Metaboliten verwendet. Anschließend wurden die Daten gegen den internen Standard normalisiert, gefolgt von einer Summenprotokolltransformation und einer Pareto-Skalierung. Die bidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) unter Verwendung des MetaboAnalyst 5.0-Servers wurde verwendet, um die Werte (https://www.metaboanalyt.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml) mit Signifikanzniveaus von p < 0,05 zwischen unabhängigen Gruppen statistisch zu validieren. Die normalisierten und validierten Daten wurden dann zur Visualisierung und Validierung der Daten nach SIMCA-P + Version 12.0 (Umetrics AB, Umea, Schweden) exportiert, wobei die Modelle „Principal Component Analysis“ (PCA) und „Partial Least Squares Discriminant Analysis“ (PLS-DA) zum Einsatz kamen. Die Heatmap mit hierarchischer Clusteranalyse wurde ebenfalls durchgeführt.

Die Analyse der Signalweganreicherung wurde mit MetPa und der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) durchgeführt, um die Wechselwirkungen der Stoffwechselwege zu visualisieren. Listen von Metaboliten, die in der Milz und Leber von überlebenden infizierten Zackenbarschen vorhanden sind, die mit Kontroll- und Fettsäurefutter gefüttert wurden, wurden hochgeladen, und die den Metabolitenlisten entsprechenden Pfade wurden für beide Probensätze extrahiert. Diese Pfade wurden dann mit den in KEGG aufgeführten Pfaden abgeglichen, um die Interaktion der Pfade untereinander zu visualisieren. Eine vergleichende Analyse wurde durchgeführt, um einzigartige Signalwege im überlebenden infizierten Zackenbarsch zu identifizieren, der mit der Ölsäure-Diät gefüttert wurde. Relevante Signalwege wurden integriert und entsprechend kartiert, um die metabolischen Anpassungen überlebender infizierter Zackenbarsche, die mit verschiedenen Fettsäurediäten gefüttert wurden, an eine Vibrio-Infektion zu verstehen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Wir dankten dem Centre for Research and Instrumentation Management (CRIM) der Universiti Kebangsaan Malaysia (UKM) für die Forschungsinstrumentierungsfonds (PIP-2010 und PIP-2013). Diese Forschung wurde durch das Research University Grant, Fördernummer GUP-2022-068 der Universiti Kebangsaan Malaysia und das Ministry of Higher Education Fundamental Research Grant, Fördernummer FRGS/1/2022/STG01/UKM/02/2 finanziert, die Syarul verliehen wurden Nataqain Baharum.

Metabolomics Research Laboratory, Institut für Systembiologie (INBIOSIS), National University of Malaysia, UKM, 43600, Bangi, Selangor, Malaysia

Maya Erna Natnan, Chen-Fei Low, Hamidun Bunawan und Syarul Nataqain Baharum

Labor für Immunogenomik, Abteilung für Aquakultur, Fakultät für Landwirtschaft, Universiti Putra Malaysia, 43400, Serdang, Selangor, Malaysia

Chou-Min Chong

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SNB, LCF und CCM konzipierten und gestalteten die Experimente. MEN führten die Experimente durch und analysierten die Daten. SNB und MEN haben das Manuskript geschrieben und redigiert. LCF, CCM und HB haben das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren überprüften und genehmigten die endgültige Version zur Einreichung.

Korrespondenz mit Syarul Nataqain Baharum.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Natnan, ME, Low, CF., Chong, CM. et al. Ölsäure als potenzielles Immunstimulans in den Stoffwechselwegen hybrider Zackenbarschjunglinge (Epinephelus fuscoguttatus × Epinephelus lanceolatus), die mit Vibrio vulnificus infiziert sind. Sci Rep 13, 12830 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40096-7

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Eingegangen: 13. Oktober 2022

Angenommen: 04. August 2023

Veröffentlicht: 08. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40096-7

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