Entdeckung und rationelle Entwicklung von PET-Hydrolase mit sowohl mesophilen als auch thermophilen PET-Hydrolase-Eigenschaften

Oct 13, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4556 (2023) Diesen Artikel zitieren

1136 Zugriffe

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Übermäßige Abfälle aus Polyethylenterephthalat (PET) verursachen eine Vielzahl von Problemen. Es wurden umfangreiche Forschungsarbeiten zur Entwicklung hochwertiger PET-Hydrolasen für das PET-Biorecycling durchgeführt. Die im Enzym-Engineering eingesetzten Template-Enzyme konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf IsPETase und Blattkompost-Cutinase, die mesophile bzw. thermophile hydrolytische Eigenschaften aufweisen. Hier berichten wir über eine PET-Hydrolase aus Cryptosporangium aurantiacum (CaPETase), die bei Umgebungstemperaturen eine hohe Thermostabilität und eine bemerkenswerte PET-Abbauaktivität aufweist. Wir enthüllen die Kristallstruktur von CaPETase, die im Vergleich zu anderen PET-Hydrolasen eine ausgeprägte Rückgratkonformation am aktiven Zentrum und Reste aufweist, die die Substratbindungsspalte bilden. Wir entwickeln eine CaPETaseM9-Variante weiter, die eine robuste Thermostabilität mit einem Tm von 83,2 °C und einer 41,7-fach erhöhten PET-Hydrolyseaktivität bei 60 °C im Vergleich zu CaPETaseWT aufweist. CaPETaseM9 zersetzt sowohl transparentes als auch farbiges Post-Consumer-PET-Pulver bei 55 °C innerhalb eines halben Tages in einem pH-Stat-Bioreaktor nahezu vollständig.

Kunststoffe sind synthetische Polymere mit den Vorteilen chemischer Beständigkeit, geringem Gewicht und niedrigen Kosten. Sie werden seit den 1950er Jahren weltweit in großem Umfang eingesetzt und sind aus unserem täglichen Leben nicht mehr wegzudenken1,2. Da sich Kunststoffe jedoch nicht auf natürliche Weise zersetzen, haben Milliarden Tonnen Plastikmüll auf Mülldeponien, auf Müllinseln im Meer und als Mikroplastik verteilt, zu einer schweren globalen Umweltverschmutzung geführt3,4,5,6,7. Regierungen und Kunststoffhersteller auf der ganzen Welt sind sich dieser Probleme bewusst, und die Forschung und Entwicklung mit Schwerpunkt auf chemischen und biologischen Recyclingstrategien für Kunststoffabfälle hat in den letzten Jahren an Fahrt gewonnen8,9,10.

Polyethylenterephthalat (PET), ein Polyester, der aus Einheiten von Terephthalsäure (TPA) und Ethylenglykol besteht, ist ein weit verbreitetes Kunststoffverpackungsmaterial und lässt sich relativ einfach recyceln. Studien zum biologischen Abbau von PET wurden in den letzten zwei Jahrzehnten aktiv durchgeführt8,11,12,13. Die PET-Biorecycling-Technologie umfasst die Hydrolyse von PET durch Mikroorganismen oder Enzyme und seine Umwandlung in Chemikalien mit hoher Wertschöpfung, wodurch letztendlich eine Kreislaufwirtschaft für PET entsteht11,14,15,16.

Bisher wurden verschiedene Enzyme, die PET hydrolysieren können, entdeckt und biochemisch und strukturell charakterisiert. Insbesondere die PETase aus Ideonella sakaiensis 201-F6 (IsPETase) weist die höchste PET-Hydrolyseaktivität bei Umgebungstemperaturen auf und gilt als vielversprechendes Enzym für die PET-Abfallbehandlung17. Dementsprechend werden derzeit verschiedene Enzym-Engineering-Studien durchgeführt, um die PET-Hydrolyseeffizienz und die thermische Stabilität von IsPETase zu verbessern, und es wurden Varianten mit verbesserter Leistung gemeldet18,19,20,21,22,23,24. Kürzlich wurde die aus dem Metagenom stammende Blattast-Kompostcutinase (LCC) entdeckt, die thermophile Eigenschaften aufweist25. Es hat sich gezeigt, dass seine Variante in einem Bioreaktorsystem bei 72 °C eine hohe PET-Depolymerisationsaktivität aufweist, was sie zu einem Kandidaten für das biologische PET-Recycling macht26. Darüber hinaus werden Anstrengungen unternommen, um neue PET-abbauende Enzyme sowie Enzyme aus verschiedenen Mikroorganismen und Umweltmetagenomen zu entdecken, wie z )29, Fusarium solani pisi (FsCut)30, Humicola insolens (HiC)31,32, PET233, PET533, PET633 und PHL734 wurden gemeldet. Und kürzlich wurden thermotolerante PET-Hydrolasen durch Genom-Mining in der Bioinformatik entdeckt35.

Für eine realisierbare Anwendung der enzymatischen PET-Hydrolyse ist die inhärent hohe katalytische Aktivität von PET-Hydrolasen ein entscheidender Ausgangspunkt. Auch die Nutzung der thermophilen PET-Hydrolase-Eigenschaften ist eine effiziente Strategie für die Entwicklung überlegener PET-Hydrolasen, da sich ein Hochtemperaturbetrieb nahe der Glasübergangstemperatur des PET-Materials günstig auf die PET-Abbauleistung auswirkt36. Daher ist die Entdeckung vielversprechender PET-abbauender Enzyme, die sowohl eine hohe katalytische Aktivität als auch hohe Thermostabilitätseigenschaften aufweisen, dringend erforderlich, um Einblicke in die Katalysereaktion zu gewinnen und den Anwendungsbereich effizienter PET-Biokatalysatoren zu erweitern.

Die Forschung zur Entwicklung effizienter PET-abbauender Enzyme schreitet rasant voran und es sind zahlreiche Varianten entstanden. Dennoch übertreffen kürzlich entwickelte PET-Hydrolasen die zuvor beschriebenen Enzyme in Bezug auf enzymatische Katalyse und Thermostabilität nicht. Daher konzentrieren sich die für das Enzym-Engineering verwendeten Template-Enzyme hauptsächlich auf IsPETase und LCC, die mesophile bzw. thermophile hydrolytische Eigenschaften haben. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine PET-Hydrolase aus Cryptosporangium aurantiacum (CaPETase), die eine bemerkenswerte PET-Abbauaktivität bei Umgebungstemperaturen und eine hohe Thermostabilität aufweist. Die Kristallstruktur von CaPETase weist darauf hin, dass das Enzym im Vergleich zu anderen bekannten PET-Hydrolasen über ein einzigartiges aktives Zentrum verfügt. Durch strukturgesteuertes rationales Protein-Engineering haben wir eine robuste CaPETase-Variante entwickelt, die eine deutlich erhöhte Enzymaktivität und Thermostabilität aufweist. Die Anwendbarkeit dieser Variante in der Recyclingindustrie wurde durch die Bewertung ihrer Aktivität mit einem pH-Stat-Bioreaktor weiter demonstriert.

Um eine PET-Hydrolase zu entdecken, führten wir eine Sequenzhomologieanalyse mithilfe der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) durch und wählten 10 PETase-Kandidaten aus (Einzelheiten siehe „Methoden“). Für die 10 ausgewählten PETase-Kandidaten und 17 gemeldeten PET-Hydrolasen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt. Die 27 Enzyme wurden in zwei Gruppen eingeteilt: Eine Gruppe enthielt mesophile Enzyme wie IsPETase und die andere Gruppe enthielt thermophile Enzyme wie TfCut2 und LCC (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1 und ergänzende Tabelle 1). Der phylogenetische Baum wurde weiter in 10 Untergruppen unterteilt, und drei ausgewählte PETase-Kandidaten, nämlich RZL00883.1, KOX11336.1 und SHM40309.1, bildeten diskrete Abstammungslinien mit geringen phylogenetischen Beziehungen zu den gemeldeten PET-Hydrolasen (Abb. 1a). Um die 10 ausgewählten PETase-Kandidaten (PCs) zu charakterisieren, haben wir zunächst versucht, sie in einer Signalpeptid-verkürzten Form herzustellen. Acht der zehn PETase-Kandidaten wurden erfolgreich hergestellt, mit Ausnahme von KOX11336.1 und MAM88718.1. Wir haben auch die Schmelztemperatur (Tm) der acht PETase-Kandidaten gemessen, um die Thermostabilität dieser Enzyme zu bestimmen. Die Kandidaten wiesen einen Bereich von Tm-Werten von 38,6 °C bis 70,5 °C auf (Abb. 1b und ergänzende Abb. 2). Anschließend überprüften wir die PET-Hydrolyseaktivität der acht PETase-Kandidaten in einem weiten Temperaturbereich von 30 bis 60 °C anhand mehrerer PET-Proben, wie etwa transparentem Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETTransparent), halbkristallinem PET-Pulver (Cry-PET). PET, Goodfellow Cambridge Ltd) (Kat.-Nr. ES306000) und amorphe PET-Folie (AF-PET, Goodfellow Cambridge Ltd) (Kat.-Nr. ES301445). Unter diesen Kandidaten zeigten PC3, PC7, PC8 und PC10 unter den getesteten Bedingungen relativ niedrige oder nicht nachweisbare Werte an PET-Hydrolyseaktivität (Abb. 1c und ergänzende Abb. 3). PC6, das den höchsten Tm-Wert von 70, 5 ° C aufweist, produzierte bei 30 ° C nur vernachlässigbare Mengen an PET-Hydrolyseprodukten, zeigte jedoch die optimale PET-Hydrolyseaktivität bei 50 ° C (Abb. 1b, c und ergänzende Abb. 2, 3). ). PC4 und PC5 zeigten eine relativ hohe PET-Hydrolyseaktivität bei 50 ° C bzw. 40 ° C (Abb. 1c und ergänzende Abb. 3). Überraschenderweise zeigte PC2 im Vergleich zu anderen PETase-Kandidaten eine signifikant hohe hydrolytische PET-Aktivität über einen breiten Bereich von Reaktionsbedingungen hinweg. Bemerkenswerterweise zeigte PC2 bei 30 °C eine überlegene Aktivität und produzierte im Vergleich zu anderen Kandidaten die höchste Menge an PET-Hydrolyseprodukten unter allen drei PET-Substratbedingungen. (Abb. 1c und ergänzende Abb. 3). Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse des pH-Profils für die acht PETase-Kandidaten, dass PC2 die höchste PET-Hydrolyseaktivität aufwies (ergänzende Abbildung 4). Es ist bemerkenswert, dass PC2 im Vergleich zu den anderen Enzymen eine bemerkenswerte PET-Hydrolyseaktivität zeigte und außerdem eine hohe Thermostabilität mit einem Tm-Wert von 66, 8 ° C aufwies (Abb. 1b, c und ergänzende Abb. 2). Darüber hinaus wies PC2 im Vergleich zu den anderen Enzymen das höchste lösliche Expressionsniveau auf (Abb. 1b). Diese Ergebnisse zeigen, dass PC2 über hervorragende Eigenschaften für einen effizienten PET-Abbau verfügt, einschließlich Enzymaktivität, Thermostabilität und Proteinexpressionsniveaus. Daher haben wir PC2 (Zugangscode: SHM40309.1, PETase aus Cryptosporangium aurantiacum, CaPETase) als robusteste PET-Hydrolase unter den acht getesteten PETase-Kandidaten ausgewählt. Die Messungen der Änderungen des Tm-Werts und der Aktivität durch Zugabe von Metallionen zeigten, dass PC2 kein metallionenabhängiges Enzym ist (ergänzende Abbildung 5).

ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit und eine prozentuale Identitätsmatrix der 10 ausgewählten PETase-Kandidaten (PC1–PC10) und 17 gemeldeten PET-Hydrolasesequenzen. Bootstrap-Werte für 1000 Replikationen werden an den Verzweigungskanten angezeigt. Der farbige Balken stellt den Grad der prozentualen Identität der Enzyme dar, und detaillierte prozentuale Identitätswerte sind in der ergänzenden Abbildung 31 aufgeführt. b Proteinausbeute und die Tm-Werte der 8 PCs. c PET-Hydrolyseaktivität der acht PCs. Die Reaktion wurde mit transparentem Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETTransparent, 15 mg mL-1 mit 500 nM Enzym), halbkristallinem PET-Pulver (Cry-PET, 15 mg mL-1 mit 2 µM Enzym) und amorphem PET-Pulver durchgeführt PET-Folie (AF-PET, 15 mg mL−1 mit 2 µM Enzym) in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer pH 9,0 bei verschiedenen Temperaturen (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) für 3 Tage. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. d Vergleich der PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase, IsPETase, LCC und TfCut2. Die Reaktion wurde mit Cry-PET (15 mg mL−1 mit 2 µM Enzym) in 50 mM Glycin-NaOH (pH 9,0) bei verschiedenen Temperaturen (30 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) durchgeführt 12 Std. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Als nächstes verglichen wir die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase mit der bekannter PET-Hydrolasen wie IsPETase, TfCut2 und LCC über einen breiten Temperaturbereich von 30 bis 60 °C unter Verwendung von Cry-PET als Substrat. Bei Reaktionen bei 30 ° C zeigte CaPETase eine signifikant höhere PET-Hydrolyseaktivität als LCC und TfCut2 (Abb. 1d und ergänzende Abb. 3). Darüber hinaus zeigte CaPETase eine 1,4-fach höhere Aktivität als IsPETase, von der bekannt ist, dass sie unter den gemeldeten PET-Hydrolasen die höchste PET-hydrolytische Aktivität bei Umgebungstemperatur aufweist (Abb. 1d)17. Insbesondere war die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase bei 40 °C 3,1-fach höher als die von IsPETase (Abb. 1d), wahrscheinlich weil CaPETase eine viel höhere Thermostabilität als IsPETase aufweist. Allerdings nahm die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase bei 60 °C im Vergleich zu der von LCC bei Temperaturen von 50 °C und 60 °C dramatisch ab und kehrte sich um (Abb. 1d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CaPETase eine vielversprechende PET-Hydrolase ist, die eine hohe PET-Zersetzungsfähigkeit und Thermostabilität aufweist. In Anbetracht der Tatsache, dass es wichtig ist, Verbesserungen ohne Verlust der Enzymaktivität und Thermostabilität bei der Entwicklung überlegener PET-abbauender Enzyme37 vorzunehmen, schlagen wir vor, dass CaPETase ein effizienteres Template-Enzym für das Enzym-Engineering darstellt als andere Enzyme mit extremen mesophilen und thermophilen Eigenschaften, wie z als IsPETase bzw. LCC.

Um eine strukturelle Grundlage für die hohe PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase zu schaffen, haben wir die Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1, 36 Å bestimmt (Ergänzungstabelle 2). CaPETase zeigt eine α/β-Hydrolase-Faltung und ein neunsträngiges β-Faltblatt in der Mitte, umgeben von sechs α-Helices und zwei 310-Helices (Abb. 2a und ergänzende Abb. 6). Die sequenzunabhängige paarweise Überlagerung von CaPETase mit drei unterschiedlichen PET-Hydrolasen, nämlich IsPETase, LCC und TfCut2, erzeugte globale quadratische Mittelwertabweichungswerte von 0,69, 0,65 bzw. 0,53 Å. Die Bildung einer konservierten Disulfidbindung (DS, C279/C297) und das Fehlen einer verlängerten Schleife in der Substratbindungsstelle von CaPETase legen nahe, dass das Enzym von einem Vorfahren von TfCut2 und LCC und nicht von IsPETase stammt (ergänzende Abbildung 7). Interessanterweise weist CaPETase im Vergleich zu anderen PET-Hydrolasen eine etwas andere Rückgratstruktur im aktiven Zentrum auf (ergänzende Abbildung 8). Da der Strukturvergleich unter Verwendung eines kartesischen Koordinatensystems bekanntermaßen subjektiv ist, um die detaillierten Strukturunterschiede der Hauptketten zu unterscheiden , haben wir die φ-ψ-Torsionswinkel der Hauptketten dieser vier PETasen weiter analysiert (ergänzende Abbildung 9) und festgestellt dass es lokale Unterschiede in den Torsionswinkeln des Rückgrats zwischen CaPETase und anderen PET-Hydrolasen gab (Abb. 2a und ergänzende Abb. 10). Interessanterweise zeigte CaPETase auch signifikante Unterschiede in den Torsionswinkeln des Rückgrats an den fünf Verbindungsschleifen (β3–α1, β4–α2, β6–β7, β7–α4 und β8–α5), die ein aktives Zentrum bilden, wohingegen Vergleiche der entsprechenden Schleifen zwischen den anderen drei PET-Hydrolasen zeigten weniger Unterschiede (Abb. 2a und ergänzende Abb. 11), was darauf hindeutet, dass CaPETase eine einzigartige Konformation des aktiven Zentrums aufweist. Im Vergleich zu den anderen PET-Hydrolasen gab es einige Unterschiede im Netzwerk der Rückstände, die sich vom aktiven Zentrum bis zur nahegelegenen räumlichen Umgebung erstrecken. Unter ihnen beobachteten wir einzigartige Unterschiede, die sich auf die Backbone-Torsionswinkel dieser Schleifen auswirken. In der Nähe der β3–α1-Schleife scheinen bestimmte Reste, die in der β4–α2-Schleife positioniert sind, und eine W105–L108–G124-Netzwerkkraft, die ein einzigartiges internes Seitenkettennetzwerk bilden, die Konformation der β3–α1-Schleife zu beeinflussen (ergänzende Abbildung). . 12). Tatsächlich weist die β3-α1-Schleife in molekulardynamischen Simulationen in der Nähe der aktiven Stellen anderer PET-Hydrolasen hohe quadratische Mittelwertfluktuationswerte auf39,40. Unter der β8-α5-Schleife, in der sich das katalytische H246 befindet, bildet sich ein einzigartiges A192-G212-F248-Netzwerk (ergänzende Abbildung 13). An der entsprechenden F248-Position in CaPETase haben LCC und TfCut2 einen Alaninrest, wohingegen IsPETase einen Cysteinrest hat, der eine zweite Disulfidbindung bildet. Daher kann die Positionierung eines sperrigen F248 zu erheblichen Torsionsunterschieden in der β8-α5-Schleife und der β7-α4-Schleife von CaPETase führen (ergänzende Abbildung 13). Schließlich scheint ein R176-W200-F209-Netzwerk Konformationsunterschiede in der α3-Helix und der β6-β7-Schleife auszulösen (ergänzende Abbildung 14). Wichtig ist, dass die α3-Helix das katalytische S169 enthält und die β6–β7-Schleife zuvor als wackelnde Tryptophan-haltige Schleife in der PETase von Rhizobacter gummiphilus bezeichnet wurde (ergänzende Abbildung 14) . Wir haben die Rückgratfluktuationen dieser vier PET-Hydrolasen mithilfe molekulardynamischer Simulationen weiter analysiert und CaPETase weist ein recht einzigartiges Rückgratfluktuationsprofil auf (Abb. 2b und ergänzende Abb. 15). CaPETase hat stabilere β6–β7- und β7–α4-Schleifen als mesophile IsPETase, und insbesondere zeigt das Enzym eine hohe Stabilität im vorderen Bereich der β8–α5-Katalyseschleife, wo sich H246 befindet (Abb. 2b). Allerdings zeigten die Endregion von β8–α5, die der erweiterten Schleife von IsPETase entspricht, und die vordere Region der β3–α1-Schleife die höchste bzw. niedrigste Flexibilität unter den vier Homologen (Abb. 2b). Für unser Interesse konnten die Unterschiede im Rückgrat-Schwankungsprofil genau auf das einzigartige interne Netzwerk lokalisiert werden, das die Rückgrat-Torsionswinkel dieser Schleifen beeinflusst. Daher glauben wir, dass die einzigartige Rückgratkonformation von CaPETase es dem Enzym ermöglicht, eine hohe Aktivität aufrechtzuerhalten und gleichzeitig mehrere flexible Schleifen der mesophilen PET-Hydrolase zu stabilisieren.

ein Vergleich der Rückgrat-Torsionswinkelunterschiede zwischen CaPETase und IsPETase, LCC und TfCut2. Die Struktur von fünf Verbindungsschleifen, die das aktive Zentrum von CaPETase bilden, wird in PyMoL als Kittröhrendarstellung mit demselben Durchmesser angezeigt. Die Struktur wird entsprechend den euklidischen Abstandswerten zwischen den beiden Ramachandran-Punkten der ausgerichteten Reste gefärbt. Die Farben Weiß bis Rot kennzeichnen niedrige bzw. hohe euklidische Distanzwerte. Die katalytische Triade der CaPETase ist als Stabmodell mit einem blaugrünen Kreis dargestellt. b MD-Simulationen zeigen ein einzigartiges Rückgratfluktuationsprofil von CaPETase. Cα-Atom-Effektivwertfluktuationen (RMSF, Å) der CaPETase, IsPETase, TfCut2, LCC während MD-Simulationen. c Vergleich der Reste, die die Substratbindungsspalte von CaPETase, LCC und TfCut2 bilden. Die hervorgehobenen Rückstände werden als Stabmodell dargestellt. d Deutliche Reste in der Substratbindungsstelle von CaPETase. Deutliche und konservierte Reste werden in Magenta bzw. Hellblau dargestellt. e PET-hydrolytische Aktivität der Varianten. PC-PETTransparent (15 mg mL−1) wurden mit 500 nM Enzymen bei 40 °C 24 Stunden lang in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer pH 9,0 inkubiert. Die Gesamtmenge der freigegebenen Produkte und der Tm-Wert der Varianten werden als Balken bzw. rote Punkte angezeigt. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Zusätzlich zur einzigartigen Rückgratkonformation am aktiven Zentrum zeigten Reste, die die Substratbindungsspalte von CaPETase bilden, signifikante Unterschiede im Vergleich zu anderen thermophilen PET-Hydrolasen (Abb. 2c, d). In der Nähe des wackelnden W194 besitzt CaPETase einzigartige G196- und L133-Reste, während sich in anderen PET-Hydrolasen hochkonservierte Reste befinden (Abb. 2c, d und ergänzende Abb. 7). Die Mutation dieser Reste zu den entsprechenden Resten in anderen PET-Hydrolasen wie G196L, L133Y und L133Q hatte einen negativen Einfluss auf die Enzymaktivität und/oder Thermostabilität (Abb. 2e). Die G196T-Mutation zeigte jedoch eine erhöhte Thermostabilität (Abb. 2e), die möglicherweise auf die Bildung einer Wasserstoffbrücke zwischen G196T und N195 zurückzuführen ist. CaPETase enthält außerdem einen einzigartigen I102-Rest in der β3-α1-Schleife, der die größten Torsionsunterschiede aufweist, wohingegen andere PET-Hydrolasen einen hochkonservierten Threoninrest an der entsprechenden Position enthalten, der es CaPETase wahrscheinlich ermöglicht, eine relativ breitere Substratbindungsspalte zu bilden (Abb. 2c). , d und ergänzende Abb. 16). Der Ersatz von I102 durch Threonin führte zu einer verringerten Enzymaktivität, was bestätigt, dass der Rückstand zu einer hohen Enzymaktivität beiträgt (Abb. 2e). Darüber hinaus verfügt CaPETase über einzigartige Reste wie Q107, W168 und T250 in den Regionen der β3–α1-Schleife, β8–α5-Schleife und α3, wohingegen die meisten der entsprechenden Reste in anderen thermophilen PET-Hydrolasen hoch konserviert sind (Abb . 2c, d und ergänzende Abb. 7). Die Mutation dieser Reste zu den konservierten Resten in anderen thermophilen PET-Hydrolasen verringerte die enzymatische Aktivität und/oder Stabilität, was darauf hindeutet, dass die kombinierte Positionierung dieser Reste notwendig ist, um eine optimale Substratbindungsstelle für CaPETase mit einer einzigartigen Form und Polarität zu schaffen (Abb. 2e). . Eine Ausnahme bildete die Q107S-Mutation, die zu keinen merklichen Unterschieden in der Enzymaktivität oder Thermostabilität führte (Abb. 2e). Zusammengenommen schlagen wir vor, dass zusammen mit den einzigartigen Torsionswinkeln des Rückgrats die Positionierung unterschiedlicher Reste an der Substratbindungsstelle es CaPETase ermöglicht, eine optimale Substratbindungsstelle für eine hohe hydrolytische PET-Aktivität zu bilden.

Obwohl CaPETase eine hohe PET-Hydrolyseaktivität und Thermostabilität aufweist, ist seine Leistung für industrielle Anwendungen immer noch unzureichend. Wir führten ein rationales Protein-Engineering von CaPETase durch, um die PET-Hydrolyseaktivität und Thermostabilität des Enzyms mithilfe verschiedener Strategien weiter zu verbessern, wie z. B. der Einführung von Disulfidbindungen und Wasserstoffbrücken und der Modifizierung der Proteinoberflächenladung (ergänzende Abbildung 17). Die Thermostabilität der Varianten wurde durch Messung der Tm-Werte überwacht und die PET-Hydrolyseaktivität der Varianten wurde unter Verwendung von transparentem Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETTransparent) bei Umgebungstemperatur (40 °C) gemessen. Wir haben vier Disulfidbindungen eingeführt, nämlich G76C/A143C (DS1), L180C/A202C (DS2), T204C/R233C (DS3) und R242C/S291C (DS4). Die DS2- und DS4-Mutationen erhöhten den Tm-Wert um etwa 3 °C, wohingegen die DS1- und DS3-Mutationen den Tm-Wert im Vergleich zu CaPETaseWT verringerten (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18). Darüber hinaus erhöhte die Einführung der DS2- und DS4-Mutationen die hydrolytische Aktivität von PET im Vergleich zu CaPETaseWT um mehr als 20 % (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die DS2- und DS4-Mutationen erfolgreich in CaPETaseWT gebildet wurden und positive Auswirkungen auf die Enzymaktivität und Thermostabilität hatten. Wir haben auch versucht, die Thermostabilität von CaPETase durch die Einführung nichtkovalenter Bindungen wie Wasserstoffbrücken und Salzbrücken zu verbessern, und haben sieben Mutationen entworfen, nämlich V129T (NC1), P136S (NC2), A192T (NC3), R198K (NC4) und V203T (NC5), A252N (NC6) und A257S(NC7). Davon erhöhten die NC1- und NC4-Mutationen die Tm-Werte um etwa 2 °C und steigerten die hydrolytische Aktivität von PET im Vergleich zu CaPETaseWT um 30 % (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18). Schließlich haben wir in einem Versuch, die Proteinadsorptionsfähigkeit an der PET-Oberfläche durch Modifizierung der Proteinoberflächenladung zu verbessern, fünf Mutationen entwickelt, um die Proteinoberfläche hydrophob zu machen, nämlich N109A (HP1), R151A (HP2), R157A (HP3). R160A (HP4) und R233A (HP5) sowie vier Mutationen, um die Proteinoberfläche positiv zu machen, nämlich T86R (SC1), A155R (SC2), T275R (SC3) und M294R (SC4). Leider zeigten die meisten Mutationen keine signifikanten Veränderungen oder gar negative Auswirkungen auf die Thermostabilität oder Enzymaktivität; Allerdings erhöhte die HP1-Mutation den Tm-Wert um 3,2 °C und die SC2-Mutation steigerte die PET-Hydrolyseaktivität im Vergleich zu CaPETaseWT um 20 % (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18). Insgesamt führten wir unter den 20 getesteten rational gestalteten Mutationen acht Punktmutationen ein, die zu einer verbesserten Thermostabilität und PET-Hydrolyseaktivität führten, nämlich DS2, DS4, NC1, NC4, HP1 und SC2 (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18). ). Es gab auch mehrdeutige Mutationen, die nur die Enzymaktivität oder Thermostabilität verbesserten, wie NC2, HP2 und HP5. Wir haben diese Mutationen von der endgültigen Auswahl ausgeschlossen, um eine viel bessere Variante zu entwickeln, ohne die enzymatische Aktivität oder Thermostabilität zu beeinträchtigen (Abb. 3a und ergänzende Abb. 18)37.

a Einzelpunktmutationen der CaPETase. Dargestellt werden freigesetzte PET-Hydrolyseprodukte und die Tm-Werte der Einzelpunktmutationen. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 500 nM Enzymen mit transparentem Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETTransparent, 15 mg mL−1) als Substrat in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) für 24 Stunden bei 40 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde dreifach durchgeführt; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Replikatmessung dar. b Kombinatorische Mutationen der CaPETase. PET-Hydrolyseaktivität der mit der kombinatorischen Strategie erzeugten Varianten. Dargestellt werden freigesetzte PET-Hydrolyseprodukte pro Stunde und die Tm-Werte der kombinatorischen Varianten. Die Reaktionen wurden unter Verwendung von 500 nM Enzymen mit PC-PET (15 mg mL−1) als Substrat in 100 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) bei 40 °C für 24 Stunden bzw. 60 °C für 6 Stunden durchgeführt. Die Reaktion wurde dreifach durchgeführt; Fehlerbalken stellen die Standardabweichung der Replikatmessung dar. c Vergleich der PET-Hydrolyseaktivität zwischen CaPETaseM9 und LCCICCG bei verschiedenen Temperaturen. Die Reaktionen wurden bei verschiedenen Temperaturen unter Verwendung von PC-PETTransparent (12,5 mg mL-1) mit 1 µM Enzym und Cry-PET (12,5 mg mL-1) mit 4 µM Enzym unter dem 200 mM Glycin-NaOH-Puffer pH 9,0 durchgeführt. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Wir haben die sechs oben beschriebenen Mutationen nacheinander integriert, um eine überlegene CaPETase-Variante mit höherer Thermostabilität und PET-hydrolytischer Aktivität zu entwickeln. Zuerst kombinierten wir die DS2- und DS4-Mutationen und die resultierende CaPETaseDS2/DS4-Variante zeigte einen synergistischen Effekt auf die Thermostabilität mit einem Tm-Wert von 74,3 °C (ΔTm = 7,4 °C) (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Darüber hinaus steigerte die Variante die hydrolytische Aktivität von PET bei 40 °C bzw. 60 °C um das 1,35- bzw. 4,45-fache im Vergleich zu CaPETaseWT (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Als nächstes richten wir CaPETaseDS2/DS4 als Gerüst für die nächste Kombination ein. Wir haben die NC1/NC4-, HP1- und SC2-Mutationen mithilfe unserer Engineering-Strategie einzeln in CaPETaseDS2/DS4 integriert. Die Zugabe der NC1/NC4-Mutation erhöhte den Tm-Wert signifikant um 3,9 °C und erhöhte die PET-Hydrolyseaktivität sowohl bei 40 °C als auch bei 60 °C (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Es zeigte eine 3,8- bzw. 17-fach erhöhte Aktivität bei 60 °C im Vergleich zu CaPETaseDS2/DS4 bzw. CaPETaseWT (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Die Zugabe der HP1-Mutation erhöhte den Tm-Wert um 2,7 °C und steigerte die hydrolytische Aktivität von PET bei 60 °C im Vergleich zu CaPETaseDS2/DS4 um das 1,7-fache (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Als die SC2-Mutation in die CaPETaseDS2/DS4-Variante integriert wurde, beobachteten wir keine merklichen Verbesserungen der Aktivität und Thermostabilität; Bei 60 ° C kam es jedoch zu einem leichten Anstieg der PET-Hydrolyseaktivität (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19).

Diese Ergebnisse legen nahe, dass alle vier Mutationen (NC1, NC4, HP1 und SC2) einen positiven Effekt auf die Thermostabilität und Aktivität von CaPETaseDS2/DS4 hatten; Daher haben wir die vier Mutationen in CaPETaseDS2/DS4 kombiniert, um CaPETaseDS2/DS4/NC1/NC4/HP1/SC2 (CaPETaseM8) zu erzeugen. Überraschenderweise wurde bei Zugabe aller vier Mutationen zu CaPETaseDS2/DS4 ein synergistischer Effekt auf Thermostabilität und Enzymaktivität beobachtet, und CaPETaseM8 zeigte eine deutlich erhöhte Thermostabilität mit einem Tm-Wert von 80,7 °C und einer um das 1,5- bzw. 25,8-fach erhöhten PET-Hydrolyseaktivität 40 ° C bzw. 60 ° C im Vergleich zu CaPETaseWT (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19).

Wie oben erwähnt, hatte die G196T-Mutation positive Auswirkungen sowohl auf die Thermostabilität als auch auf die Enzymaktivität (Abb. 2e); Daher haben wir schließlich CaPETaseDS2/DS4/NC1/NC4/HP1/SC2/G196T (CaPETaseM9) generiert, indem wir die G196T-Mutation in CaPETaseM8 integriert haben. CaPETaseM9 zeigte einen Tm-Wert von 83,2 °C, was einem Tm-Anstieg um 16,7 °C im Vergleich zu CaPETaseWT entspricht. Darüber hinaus erhöhte sich die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETaseM9 im Vergleich zu CaPETaseWT um das 1,7- bzw. 31,2-fache bei 40 °C bzw. 60 °C (Abb. 3b und ergänzende Abb. 19). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass G196T einen positiven Effekt auf CaPETaseWT hatte, der ähnlich wie CaPETaseM8 angewendet wurde.

CaPETaseM9 zeigte bei allen Temperaturbedingungen von 30 bis 70 °C eine viel höhere Aktivität und insbesondere bei 60 °C eine 41,7-fach höhere spezifische Aktivität als CaPETaseWT (ergänzende Abbildung 20). Das Ergebnis wurde auch in einem Scale-up-System aus 50-ml-Schüttelkolben reproduziert (ergänzende Abbildung 21). Diese Ergebnisse zeigten die verbesserte Enzymaktivität und verstärkte Thermostabilität von CaPETaseM9. Die verbesserte Thermostabilität der Variante wurde durch Hitzeinaktivierungsexperimente weiter verifiziert, bei denen CaPETaseM9 seine Aktivität auch nach 12-stündiger Inkubation bei 60 °C beibehielt, wohingegen CaPETaseWT innerhalb einer Stunde einen vollständigen Aktivitätsverlust zeigte (ergänzende Abbildung 22).

Anschließend verglichen wir die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETaseM9 mit LCCICCG gegenüber PC-PET und Cry-PET bei Temperaturen im Bereich von 30 bis 60 °C. CaPETaseM9 zeigte im Vergleich zu LCCICCG eine signifikant höhere PET-Hydrolyseaktivität bei 30 °C und 40 °C (Abb. 3c). Bei 50 °C und 60 °C zeigte CaPETaseM9 im Vergleich zu LCCICCG eine recht ähnliche Aktivität (Abb. 3c).

Um strukturelle Einblicke in die verbesserte PET-Abbaukapazität von CaPETaseM9 zu erhalten, haben wir seine Kristallstruktur mit einer Auflösung von 1,53 Å bestimmt (Abb. 4 und Ergänzungstabelle 2). Die Bildung der eingeführten DS2- und DS4-Disulfidbindungen wurde in CaPETaseM9 deutlich beobachtet, und die interatomare SS-Länge beider Disulfidbindungen lag innerhalb des optimalen Disulfidbindungslängenbereichs (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23). Interessanterweise befand sich DS4 in der Nähe einer der Calciumbindungsstellen von Cut190 und des Mutationspunkts von IsPETase R280A42,43, und die Bildung von DS4 verursachte auch signifikante Änderungen im elektrostatischen Oberflächenpotential und der Konformation benachbarter Regionen (Abb. 4 und). Ergänzende Abbildungen 23 und 24). Die Seitenkette des mutierten V129T wurde umgedreht, um eine Wasserstoffbrücke mit den benachbarten T131- und D132-Resten zu bilden, wodurch die β4-α3-Verbindungsschleife weiter stabilisiert wurde (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23 und 25). In Bezug auf R198K bewegte sich der mutierte Lysinrest nach innen, um Wasserstoffbrücken mit den Hauptketten von N195 und D222 zu bilden, wodurch die wackelige Tryptophan-haltige Schleife stabilisiert wurde (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23). Das mutierte G196T bildete eine wasservermittelte Wasserstoffbrücke mit dem benachbarten N195-Rest, was zu einer weiteren Stabilisierung der wackeligen Tryptophan-haltigen Schleife führte (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23). Die A155R-Mutation veränderte die hydrophobe Oberfläche in eine positive Ladung, was die Bindung des Enzyms an die PET-Oberfläche zu erhöhen scheint, wie in einem früheren Bericht nahegelegt (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23)44. Schließlich schien die N109A-Mutation interne hydrophobe Wechselwirkungen zu verstärken (Abb. 4 und ergänzende Abb. 23 und 26).

Die Kristallstruktur von CaPETaseM9 wird als Cartoon-Diagramm dargestellt, und die mutierten Reste werden als Stab oder als elektrostatisches Oberflächenpotentialmodell dargestellt.

Um die industrielle Anwendbarkeit von CaPETaseM9 zu bewerten, führten wir ein PET-Zersetzungsexperiment in einem pH-Stat-Bioreaktor unter Verwendung von PC-PETTransparent als Substrat durch (ergänzende Abbildung 27). Der Bioreaktor wurde bei 55 °C mit 2,70 mg Enzym ∙ gPET−1 betrieben und der pH-Wert wurde durch Zugabe von NaOH kontinuierlich auf 8,0 titriert. Die Zersetzungsrate wurde durch Überwachung der freigesetzten Mengen an MHET und TPA gemessen. Nach einer kurzen Verzögerungsphase von einer Stunde, die für die anfängliche Hydrophilisierung erforderlich war, stieg die PET-Abbaurate exponentiell an und 50 % von PC-PETTransparent waren innerhalb von 4 Stunden depolymerisiert (Abb. 5a). In der zweiten Hälfte der Reaktion nahm die Abbaugeschwindigkeit aufgrund einer Abnahme der Substratmenge leicht ab; jedoch wurde nach 12 h eine endgültige Abbaurate von 94,1 % erreicht (Abb. 5a). Dies war ein bedeutendes Ergebnis, da es zeigte, dass eine hohe Depolymerisationsrate von 90 % oder mehr sogar bei 55 °C erreicht werden konnte, was einer Temperaturbedingung entspricht, die relativ unter der Tg-Temperatur liegt. Dieses Ergebnis zeigte auch, dass CaPETaseM9 eine signifikante PET-Hydrolyseaktivität und Thermostabilität aufweist, die mit anderen Benchmark-Biokatalysatoren vergleichbar ist. Wir haben auch eine Zersetzung eines farbigen Post-Consumer-PET-Pulvers (PC-PETColored) durchgeführt, das bekanntermaßen relativ schwierig zu recyceln ist, da es Farben, Zusatzstoffe, eine mehrschichtige Struktur, Etiketten und andere Komplexitäten enthält45. Interessanterweise war die Depolymerisationsrate von PC-PETColored nahezu identisch mit der von PC-PETTransparent und zeigte eine Depolymerisation von 50 % innerhalb von 4 Stunden (Abb. 5b); Die endgültige Depolymerisationsrate von PC-PETColored betrug jedoch nach 12 Stunden 89,2 % und war damit etwas niedriger als die von PC-PETTransparent (Abb. 5b). Dies ist wahrscheinlich auf die in PC-PETColored vorhandenen Verunreinigungen zurückzuführen. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Gegensatz zu anderen Recyclingmethoden das Biorecycling von PET-Kunststoff unabhängig von der Farbe des PET-Kunststoffs erreicht werden kann.

Zersetzung von Post-Consumer-transparentem PET-Pulver (PC-PETTransparent) (a) und Post-Consumer-gefärbtem PET-Pulver (PC-PETColored) (b) in einem pH-Stat-Bioreaktor unter Verwendung von CaPETaseM9. Die Reaktionen wurden unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. c Vollständiger Abbau eines Post-Consumer-PET-Behälters mit CaPETaseM9 bei 60 °C. Die Reaktionen wurden dreifach durchgeführt; Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt.

Schließlich haben wir festgestellt, ob unbehandelte Post-Consumer-PET-Behälter durch CaPETaseM9 depolymerisiert werden können. Mit fortschreitender Depolymerisation wurde der PET-Film undurchsichtig und dünn, und der PET-Film verschwand innerhalb von 3 Tagen vollständig (Abb. 5c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CaPETaseM9 zum Abbau von PET-Kunststoffen mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften verwendet werden kann.

Da Kunststoffabfälle immer mehr zu einem Umweltproblem werden, wird die Forschung zur enzymatischen PET-Depolymerisierung von Kunststoffabfällen als nachhaltige Alternative für die Behandlung und das Recycling von Kunststoffabfällen immer häufiger betrieben. Daher wurde aktiv an der Entdeckung vielversprechender PET-abbauender Enzyme geforscht, und bis heute wurden mehr als 20 PET-abbauende Enzyme biochemisch identifiziert und charakterisiert46,47. Darüber hinaus wurden Studien zur Entwicklung robuster PET-abbauender Enzyme durch verschiedene technische Strategien, wie rationales Design, gerichtete Evolution und rechnergestützte Ansätze, durchgeführt. Obwohl Berichte über die Entwicklung effizienter PET-abbauender Enzymvarianten schnell zunehmen, konzentrieren sich die Zielenzyme für die Entwicklung überlegener Varianten auf einige wenige PET-Hydrolasen wie IsPETase und LCC, die über hervorragende katalytische bzw. Thermostabilitätseigenschaften verfügen. In dieser Arbeit berichteten wir über ein PET-abbauendes Enzym, CaPETase, mit sowohl mesophilen als auch thermophilen PET-Hydrolase-Eigenschaften; Es zeigt unter Umgebungsbedingungen eine höhere Aktivität als IsPETase und hat einen Tm-Wert von 66,8 °C. Als Schlüsselstrukturmerkmale der IsPETase wurden aufgrund ihrer hohen Aktivität bei Umgebungstemperatur eine Positionierung von Serin für das Wackeln von Tryptophan und eine erweiterte Schleife für den Enzym-Substrat-Zugang vorgeschlagen21,22,48. Obwohl CaPETase bei Umgebungstemperatur eine hohe Aktivität zeigt, weist das Enzym diese Strukturmerkmale der mesophilen PET-Hydrolase nicht auf (ergänzende Abbildung 7). Darüber hinaus zeigte das Fluktuationsprofil des Rückgrats, dass die Gesamtflexibilität am aktiven Zentrum geringer ist als die von IsPETase (Abb. 2b), was darauf hindeutet, dass es bei Umgebungsbedingungen aufgrund eines anderen Strukturmerkmals als IsPETase eine hohe Aktivität aufweist. Die Strukturanalyse von CaPETase mit drei repräsentativen PET-abbauenden Enzymen, wie IsPETase, TfCut2 und LCC, zeigte, dass CaPETase einzigartige Rückgrattorsionen der Schleifen des aktiven Zentrums aufweist, die durch drei große interne Netzwerkunterschiede verursacht werden. Eines der unterschiedlichen internen Netzwerke befindet sich unter der β8-α5-Schleife (ergänzende Abbildung 13). Es ist bemerkenswert, dass die einzigartige Disulfidbindung von IsPETase dieser Region entspricht und dass der Ersatz der beiden Cysteinreste durch Alanin die hydrolytische Aktivität von BHET und PET erheblich verringert22. Im Vergleich zu LCC und TfCut2 mit einem AAT-Netzwerk verfügt CaPETase über ein einzigartiges G212-F248-A192-Netzwerk, bei dem die sperrige hydrophobe Seitenkette in der Kernregion „verankert“ ist (ergänzende Abbildung 13). Vermutlich ermöglichte das verankernde Phenylalanin im Netzwerk CaPETase, eine geringere Störung der katalytischen H246-Position im vorderen Bereich der β8–α5-Schleife aufrechtzuerhalten, obwohl das Enzym im mittleren Bereich der β8–α5-Schleife eine relativ höhere Rückgratfluktuation aufweist (Abb . 2b, c). Die mittlere Region der β8–α5-Schleife in CaPETase enthält einen einzigartigen T250-Rest, der mit W168 und der β3–α1-Schleife interagiert (Abb. 2b, c). Die Bildung dieser einzigartigen Umgebung erstreckt sich auf das einzigartige W105-L108-G124-Netzwerk an der Schnittstelle zwischen den Schleifen β3–α1 und β4–α2 (ergänzende Abbildung 12). Bemerkenswert ist auch das R176-W200-F209-Netzwerk der β6–β7-Schleife, da berichtet wurde, dass diese Region für die Aktivität mesophiler Enzyme wichtig ist 41, 42, 48. Zusammengenommen scheinen die einzigartigen Strukturmerkmale und das Rückgratdynamikprofil von CaPETase gleichzeitig zu seiner Stabilität und hohen Aktivität beizutragen.

Durch das rationale Design von CaPETase wurde eine kombinatorische Gerüstkonstruktion durchgeführt, um die thermische Stabilität und die katalytische Effizienz des Enzyms zu erhöhen, und als Ergebnis wurde eine erhebliche Verbesserung des Tm-Werts (ΔTm = 16,7 °C) und der katalytischen Wirksamkeit (um 41,7 erhöht) erzielt -Falten). Im Rahmen weiterer Bemühungen zur Bewertung der Kapazität von CaPETaseM9 ergaben Vergleiche mit Benchmark-Enzymen und dem Betrieb eines pH-Stat-Bioreaktors, dass CaPETaseM9 über eine ausreichende PET-Zersetzungsleistung für industrielle Anwendungen verfügt. So haben wir durch strukturgesteuertes rationales Protein-Engineering von CaPETase CaPETaseM9 mit deutlich verbesserter PET-Hydrolyseaktivität und Thermostabilität entwickelt und gezeigt, dass diese Variante über eine ausreichende PET-Depolymerisationsfähigkeit für industrielle Anwendungen verfügt. Unsere technische Strategie könnte zusammen mit dem in dieser Studie verwendeten rationalen Design Erkenntnisse für die Verbesserung der katalytischen Aktivität und Thermostabilität anderer Enzyme liefern. Das Aufkommen einer CaPETase mit sowohl mesophilen als auch thermophilen PET-Hydrolase-Eigenschaften wird das Spektrum an Enzymen für das Enzym-Engineering erweitern und die Umsetzung des biologischen Recyclings von PET beschleunigen.

Das in dieser Studie verwendete transparente Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETTransparent) und gefärbte Post-Consumer-PET-Pulver (PC-PETColored) wurde durch Mahlen von PET-Flocken hergestellt, die von einem Recyclingunternehmen (Yoochang R&C, Republik Korea) gekauft wurden. Vor dem Mahlen zur Herstellung von PET-Pulver wurden die PET-Flocken mit Wasser gewaschen und 6 Stunden lang bei einer Temperatur von 160 °C getrocknet. Die weitgehend getrockneten PET-Flocken wurden dem Doppelschneckenextruder mit eingestellten Temperaturen von 260 °C in den Extruderzonen, 275 °C in den Austragszonen bei 275 °C und 275 °C in der Düsenplatte sowie einer Extrusionsgeschwindigkeit zugeführt von 50 U/min. Anschließend wurde das Filament nacheinander in zwei Wasserbädern bei Temperaturen von 75 °C und 60 °C abgekühlt und überschüssiges Wasser mit Luftwischern entfernt. Dann wurde zum Pelletieren eine Einlochmatrize mit einem Durchmesser von 3,0 mm verwendet, was zu Pellets mit einer Länge von etwa 3 mm führte. Die erhaltenen PET-Pellets wurden mit einer kryogenen Mikrokugelmühle mikronisiert. Die Analyse der Partikelgrößenverteilung der PET-Proben wurde mit einem Partikelgrößenanalysator HORIBA LA 960S2 gemäß ISO 13320 durchgeführt. Die Partikelgrößenverteilungen, Kristallinitäten und Molekulargewichte (Mn, Mw, Mz) von PC-PETTransparent und PC-PETColored sind dargestellt in den ergänzenden Abbildungen. 28, 29 und Ergänzungstabelle. 3.

Sequenzen wurden aus der NCBI-Datenbank für nichtredundante (nr) Proteinsequenzen über PSI-BLAST (Parameter: E-Wert von 1,00E-58, % Identität >40 %) unter Verwendung von I. sakaiensis-PETase (Zugangscode: GAP38373.1) zur Abfrage abgerufen das Model. Teilweise Gene wurden aus den abgerufenen Sequenzen entfernt und dann wurden Sequenzen der PETase-Kandidaten zufällig aus dem Datensatz ausgewählt. Das Alignment mehrerer Sequenzen wurde mit Clustal omega49 durchgeführt. Die phylogenetische Rekonstruktion wurde mittels Maximum Likelihood (ML) unter Verwendung von MEGA11 mit Dayhoff w/freq durchgeführt. Modell50,51. Der Baum mit der höchsten Log-Likelihood (−10401,10) wird angezeigt. Erste Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch durch Anwendung der Neighbor-Join- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix paarweiser Abstände ermittelt, die mithilfe des JTT-Modells geschätzt wurden. Anschließend wurde die Topologie mit einem höheren Log-Likelihood-Wert ausgewählt. Die diskrete Gammaverteilung wurde verwendet, um Unterschiede in der Evolutionsrate zwischen Standorten zu modellieren (5 Kategorien [+G, Parameter = 1,6961]). Das Ratenvariationsmodell ermöglichte, dass einige Standorte evolutionär invariabel waren ([+I], 4,28 % Standorte). Diese Analyse umfasste 27 Aminosäuresequenzen und der endgültige Datensatz enthielt insgesamt 444 Positionen. Bootstrap-Werte wurden aus 1000 Replikaten ermittelt52. Die Sequenzausrichtung von Enzymen, die in der phylogenetischen Baumanalyse verwendet werden, wurde als grafische Darstellung mit ESPript3 dargestellt (ergänzende Abbildung 1)53. Die paarweise Identität und Ähnlichkeit der Proteine ​​wurden mit der Clustal-Omega-Methode berechnet und mit der Excel-Software eine Sequenzidentitätsmatrix erstellt.

Alle in dieser Studie verwendeten Proteine ​​waren für die E. coli-Expression optimierte Codons. Die Signalpeptidsequenzen wurden entfernt und NdeI- und XhoI-Restriktionsstellen an den 5'- bzw. 3'-Enden der Zielgensequenzen hinzugefügt. Diese DNA-Sequenzen wurden von Twist Bioscience ohne Signalpeptidsequenzen synthetisiert. Die Signalpeptidschnittstellen für jede Sequenz wurden mit dem SignalP 3.0-Server vorhergesagt. Zehn PETase-Kandidatengene sowie TfCut2 und LCC wurden in einen pET21b-Expressionsvektor subkloniert, und IsPETase wurde in einen pET15b-Expressionsvektor subkloniert. Ortsgerichtete Mutageneseexperimente wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführten Oligonukleotiden durchgeführt. Alle Varianten wurden durch Sequenzierung verifiziert.

Die konstruierten Vektoren wurden in den E. coli-Stamm Rosetta gami-B (DE3) transformiert, der in Lysogenie-Brühe mit 100 mg L-1-Ampicillin bei 37 °C gezüchtet wurde, bis die optische Dichte der Kulturbrühe bei 600 einen Wert von 0,6 erreichte nm. Nach der Induktion durch Zugabe von 0,5 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid wurde die Kultur 20 Stunden lang bei 18 °C weiter inkubiert. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 4000 × g und 20 ° C geerntet. Das Zellpellet der 10 PETase-Kandidaten LCC und TfCut2 wurde in Lysepuffer A (40 mM Tris-HCl, pH 8,0) resuspendiert, und das Zellpellet von IsPETase wurde in Lysepuffer B (50 mM Na2HPO4-HCl, pH) resuspendiert 7.0). Die Zelllyse wurde mittels Ultraschall durchgeführt und die Zelllysate wurden 30 Minuten lang bei 13.500 × g zentrifugiert. Die zellfreien Rohenzyme wurden unter Verwendung einer Ni-NTA-Agarosesäule (Qiagen) gereinigt. Nach dem Waschen mit den Puffern A und B, die 30 mM Imidazol enthielten, wurden die Zielproteine ​​mit 300 mM Imidazol in den Puffern A und B eluiert. Alle Proteinreinigungsexperimente wurden bei 4 °C durchgeführt. Die gereinigten Proteine ​​wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese verifiziert und mit einem BioTekTM Epoch-Mikroplatten-Spektrophotometer und der Gen5TM-Mikroplatten-Datenanalysesoftware quantifiziert. Die gereinigten Enzyme wurden unter Verwendung einer Amicon Ultra Centrifugal-Filtereinheit (Molekulargewichtsgrenzwert 10.000, Millipore, Billerica, MA, USA) konzentriert. Die Expression und Reinigung der CaPETase-Varianten erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie beim Wildtyp.

Die thermische Stabilität der Enzyme wurde durch die Erstellung von Schmelzkurven mit einem Protein-Thermal-Shift-Farbstoff (Applied Biosystems) unter Verwendung eines StepOnePlus-Echtzeit-PCR-Instruments (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Reaktionsmischung enthielt 5 µg Proteine, 100 mM Na2HPO4-HCl (pH 7,0) und 20 µL 1× Protein-Thermoverschiebungsfarbstoff. Signaländerungen, die eine Proteindenaturierung darstellen, wurden durch Erhöhen der Temperatur von 25 °C auf 99 °C überwacht. Die Schmelztemperaturen wurden anhand der Kurve der ersten Ableitung geschätzt. Die ersten Ableitungskurven der RFU für CaPETaseWT und seine Varianten sind in der ergänzenden Abbildung 30 dargestellt.

Die Kristallisation von CaPETaseWT und CaPETaseM9 wurde zunächst mit den kommerziell erhältlichen Ersatzmatrixsieben Wizard I und II (Rigaku), PEG/Ion, Index (Hampton Research) und Wizard CRYO I und II (Rigaku) ​​unter Verwendung der Dampfdiffusionsmethode mit sitzendem Tropfen durchgeführt bei 20 °C. Für jedes Experiment wurden 1,0 µL der Proteinlösung (CaPETaseWT: 18,4 mg mL−1 in 40 mM Tris, pH 8,0 und CaPETaseM9: 22,3 mg mL−1 in 40 mM Tris, pH 8,0) mit 1,0 µL Reservoirlösung gemischt und der Tropfen wurde gegen 50 µL Reservoirlösung äquilibriert. Der Kristall von CaPETaseWT erschien unter Bedingungen von 12 % (v/v) PEG 3350 und 0,1 M Natriummalonat (pH 4,0). Der Kristall von CaPETaseM9 wurde unter Bedingungen von 10 % (v/v) Polyethylenglykolmonomethylether 5.000, 0,1 M HEPES, pH 7,0 und 5 % Tacsimat, pH 7,0 gebildet. Die hochwertigsten Kristalle von CaPETaseWT und CaPETaseM9 wurden in eine Kryoschutzmittellösung überführt, die aus den entsprechenden oben beschriebenen Bedingungen mit 25 % (v/v) Glycerin bestand. Die Kristalle wurden mit einer Schlinge herausgefischt und mit einem Ausguss flüssigen Stickstoffs schockgefroren. Die Daten wurden mit einer 7-A-Beamline des Pohang Accelerator Laboratory (Republik Korea) unter 100 K54 gesammelt. Alle Beugungsdaten wurden mit der HKL2000-Software55 indiziert, integriert und skaliert. Die CaPETaseWT-Kristalle gehörten zu einer Raumgruppe P21212 mit einem Elementarzellenparameter: a = 82,31 Å, b = 82,45 Å, c = 87,39 Å und α = β = γ = 90°. Die beiden CaPETaseWT-Moleküle befanden sich in einer asymmetrischen Einheit und das Kristallvolumen pro Proteineinheit betrug 2,68 Å3 Da−1, was einem Lösungsmittelgehalt von 52,25 % entspricht56. Die Struktur von CaPETaseWT wurde durch molekularen Ersatz mit der CCP4-Version von MOLREP bestimmt, wobei die Struktur von Cutinase 1 aus Thermobifida cellulosilytica (PDB-Code: 5LUI) als Suchmodell verwendet wurde57,58. Das Strukturmodell wurde mit dem WinCoot-Programm erstellt und die Strukturverfeinerung wurde mit dem CCP4 REFMAC5-Programm59,60 durchgeführt. Der Kristall von CaPETaseM9 gehörte zur Raumgruppe P21212 mit einem Elementarzellenparameter: a = 41,02 Å, b = 112,31 Å, c = 112,54 Å und α = β = γ = 90°. Die asymmetrische Einheit enthielt zwei Moleküle CaPETaseM9 und das Kristallvolumen pro Proteineinheit betrug 2,3468 Å3 Da−1, was einem Lösungsmittelgehalt von 45,37 % entspricht56. Die Struktur von CaPETaseM9 wurde durch molekularen Ersatz mit der CCP4-Version von MOLREP unter Verwendung der Struktur von CaPETaseWT als Suchmodell57 bestimmt. Der Modellaufbau und die Verfeinerung wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Die Statistiken sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst. Die Strukturen von CaPETaseWT und CaPETaseM9 wurden in der Proteindatenbank mit den PDB-Codes 7YM9 bzw. 7YME hinterlegt.

Die hinterlegten Strukturen von 5XJH (G30-S290), 4EB0 (S36-Q293), 4CG1 (A1-F261) und 7YM9 (D43-F299) wurden für IsPETase-, LCC-, TfCut2- und CaPETase-Reste sowie Wasserkoordinaten im inneren Hohlraum verwendet. Alle Proteinmodelle wurden mit Protonierungszuständen bei pH 9 hergestellt, wie von propka361 berechnet. Die Systeme wurden mit ff19SB- und OPC-Parametern für Protein und explizites Wasser hergestellt und in einer kubischen Box von 70 Å Länge mit 0,1 M Na+- und Cl--Ionen solvatisiert. Wir haben die Systeme mithilfe von Gromacs mit konjugiertem Gradientenalgorithmus minimiert und für 1 ns bei 323,15 K NVT-äquilibriert und dann für 1 ns NPT-äquilibriert mit einer Kraftbeschränkung von 1000 kJ∙mol−1∙nm−2. Produktionssimulationen wurden für 200 ns bei 323,15 K durchgeführt und RMS-Schwankungen wurden mit 10 ps-Intervalltrajektorien berechnet. Alle Simulationen wurden mit Gromacs 2021.3 Version package62 durchgeführt.

Im vorläufigen PET-Abbautest von acht PETase-Kandidaten wurde PC-PETTransparent (15 mg mL-1) in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH 9,0, mit 500 nM Enzym eingeweicht. Cry-PET (15 mg mL−1) und gelochter amorpher PET-Film (⌀6 mm, etwa 10 mg) wurden in 50 mM Glycin-NaOH-Puffer, pH 9,0, mit 2 µM Enzym eingeweicht. Die Reaktionsmischungen (1 ml) wurden dann 3 Tage lang bei Temperaturen von 30 °C, 40 °C, 50 °C und 60 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10-minütiges Erhitzen der Mischung auf 95 °C beendet. Die Reaktionsmischung mit PET-Pulver wurde mit einem PVDF-Spritzenfilter (0,22 µm) filtriert, um das restliche Substrat zu entfernen. Anschließend wurden die Proben mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die pH-Profile von acht PETase-Kandidaten wurden mit PC-PETTransparent (15 mg mL−1) in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 6–7), 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7–9) und 50 mM Glycin erstellt -NaOH-Puffer (pH 9-10) bei 30 °C für 3 Tage. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Um die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETase mit LCC, IsPETase und TfCut2 zu vergleichen, wurden 15 mg Cry-PET hergestellt und in 1 ml 50 mM Glycin-NaOH-Puffer pH 9,0 mit 2 µM Enzym getaucht. Die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden lang bei 30 °C, 40 °C, 50 °C und 60 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktionsmischung wie oben beschrieben behandelt und mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die PET-hydrolytische Aktivität von CaPETaseWT und seinen Varianten wurde mit PC-PETTransparent bestimmt. Enzymreaktionen wurden mit 500 nM Enzymen in 1 ml 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) bei 40 °C für 24 Stunden durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde wie oben beschrieben behandelt und mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Um die PET-hydrolysierende Aktivität der kombinatorischen Varianten von CaPETase zu bewerten, wurden 500 nM Enzym mit 100 mM Glycin-NaOH (pH 9,0) und 15 mg PC-PETTransparent 24 Stunden lang bei 40 °C und 6 Stunden lang bei 60 °C inkubiert , jeweils. Die Reaktionsmischung wurde wie oben beschrieben behandelt und zweifach verdünnte Proben wurden mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Der Vergleich der PET-Hydrolyseaktivitäten von CaPETaseWT und CaPETaseM9 wurde unter Verwendung von PC-PETTransparent (15 mg mL−1) bei 30, 40, 50, 60, 70 °C mit 1 µM Enzymen in 1 ml 50 mM Glycin-NaOH (pH) durchgeführt 9,0) Puffer. Um CaPETaseM9 für die PET-Depolymerisation weiter zu bewerten, wurde das Enzym (1 µM) zu 50 ml 200 mM Glycin-NaOH, pH 9,0, mit 100 mg PC-PETTransparent in einem 250-ml-Kolben gegeben. Der Kolben wurde in einem Schüttelinkubator bei 40 °C, 50 °C, 60 °C und 180 U/min (40 °C für 72 h, 50 °C für 48 h und 60 °C für 12 h) inkubiert. Den Reaktionsmischungen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten Proben entnommen, um die Gesamtmenge der freigesetzten PET-Monomere zu quantifizieren. Die Proben wurden wie oben beschrieben filtriert und vierfach verdünnte Proben mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Um die PET-Hydrolyseaktivität von CaPETaseM9 mit LCCICCG zu vergleichen, wurde ein membranumschlossenes enzymatisches Katalysesystem (MEEC) verwendet. In diesem System wurde die PET-Abbaureaktion auf einer Cellulosedialysemembran (Spectra/Por 2 Trial Kit, 12–14 kD, flache Breite 25 mm; Repligen, USA) induziert, und PC-PETTransparent und Cry-PET wurden als Substrat verwendet . 50 (± 2) mg PC-PETTransparent- und Cry-PET-Substrat wurden in 4 ml 200 mM Glycin-NaOH pH 9,0 mit 1 µM bzw. 4 µM Enzym eingetaucht. Jede Reaktion wurde in einem 4-ml-Dialysebeutel verpackt und in 200 ml 200 mM Glycin-NaOH, pH 9,0, getaucht. Die Reaktion wurde bei 30 °C, 40 °C, 50 °C und 60 °C unter Schütteln bei 80 U/min in einem kleinen Schüttelinkubator (JEIO TECH, Republik Korea) durchgeführt. Die Probe wurde aus der externen Gleichgewichtslösung entnommen, 5-fach verdünnt und dann per HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Experimente zur Hitzeinaktivierung von Proteinen wurden mit CaPETaseWT und CaPETaseM9 durchgeführt. Enzymmischungen (500 nM Enzym in 1 ml 50 mM Glycin-NaOH, pH 9,0) wurden 10 Minuten bis 12 Stunden bzw. 5 Minuten bis 12 Stunden bei 60 °C und 70 °C inkubiert. Anschließend wurden der hitzeinaktivierten Mischung 15 mg PC-PETTransparent zugesetzt und die Reaktionsmischung einen Tag lang bei 40 °C inkubiert. Die Mischung wurde mit einem PVDF-Spritzenfilter (0,22 µm) filtriert und die Proben mittels HPLC analysiert.

Für die PET-Depolymerisation wurde ein maßgeschneiderter Rührbioreaktor (MARADO-PDA, BIOCNS Co. Ltd, Korea) entwickelt, der mit zwei Standard-Rushton-Laufrädern ausgestattet ist. Zur Datenaufzeichnung war es mit einem Personalcomputer verbunden. Die Temperatur wurde mithilfe eines Kühl- und Heizbadzirkulators (RW3-1025, JEIO TECH, Daejeon, Republik Korea) reguliert. CaPETaseM9 (10,2 mg) wurde zu einer 150-ml-Lösung mit 10 mM Na2HPO4 (pH 8,0) und 3,75 g PC-PET gegeben und bei 55 °C und 200 U/min inkubiert. Der pH-Wert wurde durch Zugabe einer 0,3575 M NaOH-Lösung (40 %; extra reine Qualität, Duksan, Republik Korea) unter Verwendung eines PID-Reglers auf 8,0 reguliert. Während der Reaktion wurden Proben der Reaktorlösung entnommen und durch einen PVDF-Spritzenfilter (0,22 µm) filtriert, um restliches PET-Pulver zu entfernen. Die resultierenden Proben wurden mit 50 mM Glycin-NaOH (pH 9,0) verdünnt und mittels HPLC analysiert, um die Menge des freigesetzten PET-Monomers zu quantifizieren. Die PET-Depolymerisationsrate wurde unter Berücksichtigung der Summe der Hydrolyseprodukte (TPA und MHET) berechnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Fragmente eines Post-Consumer-PET-Behälters (Salatbehälter) wurden in kreisförmiger Form (⌀14 mm, 50 mg) hergestellt. Die Reaktion wurde mithilfe einer membranumschlossenen enzymatischen Katalysemethode durchgeführt. Der Dialysemembranbeutel (Carl Roth, Produktnummer 0653.1, MWCO 14000) wurde mit 1 µM CaPETaseM9, gelöst in 4 ml 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) und Post-Consumer-PET-Fragment beladen. Der gefüllte Membranbeutel wurde in einen Behälter mit 196 ml 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 9,0) getaucht und auf einem Schüttler 84 Stunden lang bei 60 °C und 80 U/min inkubiert. Zu unterschiedlichen Zeitpunkten (0, 12, 24, 30, 36, 48, 60, 72 und 84 h) wurden der Lösung an der Außenseite Proben entnommen, um die Gesamtmenge der freigesetzten PET-Monomere zu quantifizieren. Die Proben wurden mittels HPLC analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Proben wurden mit einem CBM-20A (Shimadzu, Kyoto, Japan) analysiert, das an einen UV/Vis-Detektor (SPD-20A) und eine C18-Säule (Shimadzu Shim-pack GIS ODS-I C18, 5 µm, 4,6 × 150 mm) angeschlossen war. . Die mobilen Phasen A (0,1 % Ameisensäure) und B (20 % Acetonitril) wurden mit einer Flussrate von 1 ml min−1 verwendet. Das Elutionsprogramm war wie folgt: 0–2 Minuten, 60–80 % Puffer B, linearer Gradient; 2–8 Min., 80–100 % Puffer B, linearer Gradient; 8–16 min, 100 % Puffer B. Die Hydrolyseprodukte (TPA, MHET und BHET) wurden bei 40 °C getrennt und bei 260 nm nachgewiesen. Die Mengen an TPA, MHET und BHET wurden unter Verwendung von Standardkurven gemessen, die aus kommerziellem TPA (Sigma-Aldrich, MO, USA, Kat.-Nr.: 185361) und BHET (Sigma-Aldrich, MO, USA, Kat.-Nr.: 465151) erstellt wurden ) und MHET (Ambeed, IL, USA, Kat.-Nr.: A875019).

Die thermische Kristallinität von PET-Proben wurde mithilfe eines Differentialscanning-Kalorimetrie-Instruments (DSC) (Q2000, TA-Instrument) geschätzt. Für die DSC-Thermographie wurden 5 mg Proben bei 30 °C äquilibriert und mit einer Heizrate von 10 °C min−1 auf 300 °C erhitzt. Die Probe wurde bei 10 °C min−1 auf 30 °C abgeschreckt. Schmelzwärme (ΔHm) und Kaltkristallisation (ΔHc) wurden durch Integration der Flächen (J g-1) unter den Peaks bestimmt. Die Schmelzenthalpie für ein vollkristallines PET (∆Hf) betrug 140,1 J/g. Der Prozentsatz der Kristallinität wurde anhand der folgenden Gleichung berechnet:

DSC-Kurven für die Kristallinität der PET-Proben sind in der ergänzenden Abbildung 29 dargestellt.

Das Molekulargewicht der PET-Proben wurde mittels Gelpermeationschromatographie (GPC) unter Verwendung eines EcoSEC HLC-8320 GPC-Instruments (Tosoh Bioscience, Tokio, Japan) gemessen. Die TSKgel SuperAWM-H-Säule wurde mit einer mobilen Phase aus 0,01 N Natriumtrifluoracetat (NaTFA) in Hexafluorisopropanol (HFIP) bei einer Flussrate von 0,3 ml min−1 bei 40 °C und einer Laufzeit von 30 Minuten pro Probe verwendet. Das injizierte Probenvolumen betrug 20 μL. Die Molekulargewichte (Mn, Mw, Mp) wurden relativ zu Polymethylmethacrylat (PMMA)-Standards bestimmt. Die PET-Proben und PMMA wurden in 6 % v/v Hexafluorisopropanol (HFIP) in Chloroform auf eine Konzentration von 3 mg mL−1 gelöst und die Lösung durch eine Polytetrafluorethylen (PTFE)-Membran mit einer Porengröße von 0,45 μm filtriert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten verfeinerten Modelle von CaPETaseWT und CaPETaseM9 wurden in der Proteindatenbank mit den PDB-Codes 7YM9 und 7YME hinterlegt. Wir haben die folgende veröffentlichte Struktur, PDB-Code 5LUI, als Suchmodell für den anfänglichen molekularen Ersatz verwendet. Die Rohdaten für die in dieser Studie generierten Zahlen werden in der Quelldatendatei bereitgestellt. Die prozentualen Identitätswerte für in der phylogenetischen Analyse verwendete Sequenzen sind in der ergänzenden Abbildung 31 angegeben. Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Geyer, R., Jambeck, JR & Law, KL Produktion, Verwendung und Schicksal aller jemals hergestellten Kunststoffe. Wissenschaft. Adv. 3, e1700782 (2017).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibb, BC Plastics are Forever, Nature Publishing Group, (2019).

Hopewell, J., Dvorak, R. & Kosior, E. Kunststoffrecycling: Herausforderungen und Chancen. Philos. Trans. R. Soc. B: Biol. Wissenschaft. 364, 2115–2126 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Jambeck, JR et al. Meeresverschmutzung. Einträge von Plastikmüll vom Land ins Meer. Wissenschaft 347, 768–771 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Eriksen, M. et al. Plastikverschmutzung in den Weltmeeren: Mehr als 5 Billionen Plastikteile mit einem Gewicht von über 250.000 Tonnen schwimmen im Meer. PloS eins 9, e111913 (2014).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qi, Y. et al. Makro- und Mikroplastik im Boden-Pflanzen-System: Auswirkungen von Plastikmulchfolienrückständen auf das Wachstum von Weizen (Triticum aestivum). Wissenschaft. Gesamtumgebung. 645, 1048–1056 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Borrelle, SB et al. Das prognostizierte Wachstum des Plastikmülls übersteigt die Bemühungen zur Eindämmung der Plastikverschmutzung. Science 369, 1515–1518 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ellis, LD et al. Chemische und biologische Katalyse für Kunststoffrecycling und -upcycling. Nat. Katal. 4, 539–556 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Kakadellis, S. & Rosetto, G. Erreichen einer zirkulären Bioökonomie für Kunststoffe. Wissenschaft 373, 49–50 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Coates, GW & Getzler, YD Chemisches Recycling zu Monomer für eine ideale Polymerkreislaufwirtschaft. Nat. Rev. Mater. 5, 501–516 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Webb, HK, Arnott, J., Crawford, RJ & Ivanova, EP Kunststoffabbau und seine Auswirkungen auf die Umwelt unter besonderer Berücksichtigung von Poly(ethylenterephthalat). Polymere 5, 1–18 (2012).

Artikel Google Scholar

Kuczenski, B. & Geyer, R. Stoffflussanalyse von Polyethylenterephthalat in den USA, 1996–2007. Ressource, Konserv. Recycling 54, 1161–1169 (2010).

Artikel Google Scholar

Soong, Y.-HV, Sobkowicz, MJ & Xie, D. Jüngste Fortschritte beim biologischen Recycling von Kunststoffabfällen aus Polyethylenterephthalat (PET). Bioengineering 9, 98 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zimmermann, W. Biokatalytisches Recycling von Polyethylenterephthalat-Kunststoff. Philos. Trans. R. Soc. A 378, 20190273 (2020).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Tiso, T. et al. Auf dem Weg zum Bio-Upcycling von Polyethylenterephthalat. Metab. Ing. 66, 167–178 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kawai, F., Kawabata, T. & Oda, M. Aktuelles Wissen über den enzymatischen PET-Abbau und seine mögliche Anwendung in der Abfallstrombewirtschaftung und anderen Bereichen. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 103, 4253–4268 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoshida, S. et al. Ein Bakterium, das Poly(ethylenterephthalat) abbaut und assimiliert. Science 351, 1196–1199 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ma, Y. et al. Erhöhte Poly(ethylenterephthalat)hydrolase-Aktivität durch Protein-Engineering. Engineering 4, 888–893 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, B. et al. Proteinkristallographie und ortsdirekte Mutageneseanalyse der Poly(ethylenterephthalat)hydrolase-PETase aus Ideonella sakaiensis. ChemBioChem 19, 1471–1475 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Austin, HP et al. Charakterisierung und Entwicklung einer kunststoffabbauenden aromatischen Polyesterase. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 115, E4350–E4357 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Han, X. et al. Struktureller Einblick in den katalytischen Mechanismus der PET-Hydrolase. Nat. Komm. 8, 1–6 (2017).

Artikel ADS MathSciNet Google Scholar

Joo, S. et al. Struktureller Einblick in den molekularen Mechanismus des Poly(ethylenterephthalat)-Abbaus. Nat. Komm. 9, 1–12 (2018).

Artikel ADS Google Scholar

Cui, Y. et al. Computergestützte Neugestaltung einer PETase für den biologischen Kunststoffabbau unter Umgebungsbedingungen durch die GRAPE-Strategie. ACS Catal. 11, 1340–1350 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Lu, H. et al. Durch maschinelles Lernen unterstütztes Engineering von Hydrolasen für die PET-Depolymerisation. Natur 604, 662–667 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sulaiman, S. et al. Isolierung eines neuen Cutinase-Homologs mit Polyethylenterephthalat-abbauender Aktivität aus Blattkompost mithilfe eines metagenomischen Ansatzes. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 78, 1556 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tournier, V. et al. Eine entwickelte PET-Depolymerase zum Abbau und Recycling von Plastikflaschen. Natur 580, 216–219 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Dann haben J. et al. Die Veränderung der Ca2+- und Mg2+-Bindungsstellen erhöht den Abbau von Polyethylenterephthalatfilmen durch Polyesterhydrolasen aus Thermobifida fusca. Biotechnologie. J. 10, 592–598 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wei, R. et al. Funktionelle Charakterisierung und Strukturmodellierung synthetischer Polyester abbauender Hydrolasen aus Thermomonospora curvata. AMB Express 4, 1–10 (2014).

Artikel MathSciNet CAS Google Scholar

Xi, X. et al. Sekretorische Expression in Bacillus subtilis und biochemische Charakterisierung einer hoch thermostabilen Polyethylenterephthalat-Hydrolase aus dem Bakterium HR29. Enzym. Mikrob. Technol. 143, 109715 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Heredia, A. Biophysikalische und biochemische Eigenschaften von Cutin, einem Pflanzenbarriere-Biopolymer. Biochimica et. Biophys. Acta (BBA)-Gen. Betreff. 1620, 1–7 (2003).

Artikel CAS Google Scholar

Ronkvist, Å. M., Xie, W., Lu, W. & Gross, RA Cutinase-katalysierte Hydrolyse von Poly(ethylenterephthalat). Macromolecules 42, 5128 (2009).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ribitsch, D. et al. Charakterisierung einer neuen Cutinase aus Thermobifida alba für die PET-Oberflächenhydrolyse. Biokatalysator. Biotransformation. 30, 2 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Danso, D. et al. Neue Erkenntnisse zur Funktion und globalen Verbreitung von Polyethylenterephthalat (PET) abbauenden Bakterien und Enzymen in marinen und terrestrischen Metagenomen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 84, e02773–02717 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sonnendecker, C. et al. CO2-armes Recycling von Post-Consumer-PET-Kunststoff mit einer metagenomischen Polyesterhydrolase. ChemSusChem 15, e202101062 (2022).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Erickson, E. et al. Beschaffung thermotoleranter Poly(ethylenterephthalat)-Hydrolase-Gerüste aus der natürlichen Vielfalt. Nat. Komm. 13, 7850 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomsen, TB, Hunt, CJ & Meyer, AS Einfluss der Substratkristallinität und der Glasübergangstemperatur auf den enzymatischen Abbau von Polyethylenterephthalat (PET). N. Biotechnologie. 69, 28–35 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lee, SH et al. Balance-gesteuertes Protein-Engineering von IsPETase verbessert sowohl die PET-Hydrolyseaktivität als auch die Thermostabilität. Vorabdruck unter https://doi.org/10.1101/2022.11.14.516528 (2022).

Kufareva, I. & Abagyan, R. Methoden zum Vergleich der Proteinstruktur. Methoden Mol. Biol. 857, 231–257 (2012).

Charupanit, K., Tipmanee, V., Sutthibutpong, T. & Limsakul, P. In-silico-Identifizierung potenzieller Standorte für ein plastikabbauendes Enzym durch ein umgekehrtes Screening durch den Proteinsequenzraum und Molekulardynamiksimulationen. Molecules 27, 3353 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fecker, T. et al. Flexibilität des aktiven Zentrums als Kennzeichen für effizienten PET-Abbau durch I. Sakaiensis Petase. Biophys. J. 114, 1302 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sagong, HY et al. Auswirkungen auf den PET-Zersetzungsmechanismus durch Ähnlichkeit und Unähnlichkeit zwischen PETasen aus Rhizobacter gummiphilus und Ideonella sakaiensis. J. Hazard Mater. 416, https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.126075 (2021).

Sohn, HF et al. Rationales Protein-Engineering der thermostabilen PETase aus Ideonella sakaiensis für einen hocheffizienten PET-Abbau. ACS Catal. 9, 3519–3526 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Oda, M. et al. Enzymatische Hydrolyse von PET: Funktionelle Rollen von drei Ca2+-Ionen, die an ein Cutinase-ähnliches Enzym, Cut190*, gebunden sind, und dessen Entwicklung für eine verbesserte Aktivität. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 102, 10067–10077 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nakamura, A., Kobayashi, N., Koga, N. & Iino, R. Die Einführung positiver Ladung auf der Oberfläche thermostabilisierter PET-Hydrolase erleichtert die Bindung und den Abbau von PET. ACS Catal. 11, 8550–8564 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Crippa, M. et al. Eine Kreislaufwirtschaft für Kunststoffe: Erkenntnisse aus Forschung und Innovation als Grundlage für politische und Finanzierungsentscheidungen. (Veröffentlichungen der Europäischen Kommission, 2019).

Carr, CM, Clarke, DJ & Dobson, AD Mikrobielle Polyethylenterephthalat-Hydrolasen: aktuelle und zukünftige Perspektiven. Vorderseite. Mikrobiol. 11, 571265 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Magalhães, RP, Cunha, JM & Sousa, SF Perspektiven zur Rolle der enzymatischen Biokatalyse für den Abbau von Kunststoff-PET. Int. J. Mol. Wissenschaft. 22, 11257 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, CC et al. Allgemeine Merkmale zur Verbesserung der enzymatischen Aktivität der Poly(ethylenterephthalat)-Hydrolyse. Nat. Katal. 4, 425 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Sievers, F. et al. Schnelle, skalierbare Generierung hochwertiger Protein-Mehrfachsequenz-Alignments mit Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Schwartz, R. Matrizen zur Erkennung entfernter Beziehungen. Atlas der Proteinsequenz und -struktur 5, 353–359 (1978).

Tamura, K., Stecher, G. & Kumar, S. MEGA11: Molekulare Evolutionsgenetische Analyse Version 11. Mol. Biol. Evolution 38, 3022–3027 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Felsenstein, J. Vertrauensgrenzen für Phylogenien: ein Ansatz unter Verwendung des Bootstrap. Evolution 39, 783–791 (1985).

Artikel PubMed Google Scholar

Robert, X. & Gouet, P. Entschlüsselung wichtiger Merkmale in Proteinstrukturen mit dem neuen ENDscript-Server. Nukleinsäuren Res. 42, W320–W324 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Park, S.-Y., Ha, S.-C. & Kim, Y.-G. Die Proteinkristallographie-Beamlines an der Pohang-Lichtquelle II. Biodesign 5, 30–34 (2017).

Google Scholar

Otwinowski, Z. & Minor, W. [20] Verarbeitung von im Oszillationsmodus gesammelten Röntgenbeugungsdaten. Methoden Enzymol. 276, 307–326 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Matthews, BW Lösungsmittelgehalt von Proteinkristallen. J. Mol. Biol. 33, 491–497 (1968).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Vagin, A. & Teplyakov, A. Molekularer Ersatz mit MOLREP. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 66, 22–25 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ribitsch, D. et al. Kleine Ursache, große Wirkung: Strukturelle Charakterisierung von Cutinasen aus Thermobifida cellulosilytica. Biotechnologie. Bioeng. 114, 2481–2488 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: Modellbauwerkzeuge für molekulare Grafiken. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 60, 2126–2132 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Murshudov, GN, Vagin, AA & Dodson, EJ Verfeinerung makromolekularer Strukturen durch die Maximum-Likelihood-Methode. Acta Crystallogr D. Biol. Crystallogr 53, 240–255 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Olsson, MH, Søndergaard, CR, Rostkowski, M. & Jensen, JH PROPKA3: Konsistente Behandlung interner und Oberflächenreste in empirischen p K a -Vorhersagen. J. Chem. Theorie Comput. 7, 525–537 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Páll, S. et al. Heterogene Parallelisierung und Beschleunigung von Molekulardynamiksimulationen in GROMACS. J. Chem. Physik. 153, 134110 (2020).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Referenzen herunterladen

Diese Forschung wurde durch das Bio & Medical Technology Development Program der National Research Foundation (NRF) unterstützt, das vom Ministerium für Wissenschaft und IKT (NRF-2020M3A9I5037635) finanziert wird, und durch das Cooperative Research Program for Agricultural Science & Technology Development (Projekt Nr. PJ01492602). , Verwaltung für ländliche Entwicklung, Republik Korea. Diese Forschung wurde auch durch das Technology Innovation Program (20018132, Entwicklung der biologisch abbaubaren Polybutylenkunststoffe PBAT und PBS aus Biomasse) unterstützt, das vom Ministerium für Handel, Industrie und Energie (MOTIE, Korea) finanziert wurde.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Hwaseok Hong, Dongwoo Ki.

School of Life Sciences, BK21 FOUR KNU Creative BioResearch Group, KNU Institute for Microorganisms, Kyungpook National University, Daegu, 41566, Republik Korea

Hwaseok Hong, Dongwoo Ki, Hogyun Seo, Jiyoung Park & ​​​​Kyung-Jin Kim

Institut für Biotechnologie, CJ CheilJedang Co., Suwon-si, Gyeonggi-do, 16495, Republik Korea

Jaewon Jang

Zyen Co, Daegu, 41566, Republik Korea

Kyung-Jin Kim

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

K.-JK konzipierte das Projekt und betreute die Forschung. HH und DK führten das kristallographische Experiment durch und SH trug zur rechnerischen Analyse bei. HH und DK entwarfen die Enzymvarianten und führten die PET-Abbauexperimente durch. HH, DK und JP analysierten die Daten. HH und K.-JK waren an der Manuskripterstellung beteiligt. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und SH und JJ gaben Hinweise zu diesem Manuskript.

Korrespondenz mit Kyung-Jin Kim.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hong, H., Ki, D., Seo, H. et al. Entdeckung und rationelle Entwicklung von PET-Hydrolase mit sowohl mesophilen als auch thermophilen PET-Hydrolase-Eigenschaften. Nat Commun 14, 4556 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40233-w

Zitat herunterladen

Eingegangen: 4. Januar 2023

Angenommen: 13. Juli 2023

Veröffentlicht: 28. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40233-w

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.