Insulin

Mar 15, 2024

Nature Band 614, Seiten 118–124 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Diabetes stellt ein Krankheitsspektrum dar, bei dem Stoffwechselstörungen mehrere Organsysteme schädigen, darunter Leber, Nieren und periphere Nerven1,2. Obwohl der Beginn und das Fortschreiten dieser Komorbiditäten mit Insulinresistenz, Hyperglykämie und Dyslipidämie verbunden sind3,4,5,6,7, trägt ein fehlerhafter Metabolismus nicht-essentieller Aminosäuren (NEAA) auch zur Pathogenese von Diabetes bei8,9,10. Serin und Glycin sind eng verwandte NEAAs, deren Spiegel bei Patienten mit metabolischem Syndrom kontinuierlich reduziert sind10,11,12,13,14, aber die mechanistischen Treiber und nachgelagerten Konsequenzen dieses Metabotyps bleiben unklar. Ein niedriger systemischer Serin- und Glycingehalt wird auch zu einem Kennzeichen von Makula- und peripheren Nervenerkrankungen, die mit einer beeinträchtigten Sehschärfe und peripherer Neuropathie einhergehen15,16. Hier zeigen wir, dass eine fehlerhafte Serinhomöostase zu Serin- und Glycinmangel bei diabetischen Mäusen führt, was mit einem Serintoleranztest diagnostiziert werden kann, der die Serinaufnahme und -entsorgung quantifiziert. Die Nachahmung dieser Stoffwechselveränderungen bei jungen Mäusen durch eine Serin- oder Glycinrestriktion in der Nahrung zusammen mit einer hohen Fettaufnahme beschleunigt das Auftreten einer Small-Fiber-Neuropathie deutlich und reduziert gleichzeitig die Adipositas. Die Normalisierung von Serin durch Nahrungsergänzung und die Linderung von Dyslipidämie mit Myriocin lindern beide die Neuropathie bei diabetischen Mäusen und stellen einen Zusammenhang zwischen Serin-assoziierter peripherer Neuropathie und dem Sphingolipid-Metabolismus her. Diese Ergebnisse identifizieren systemischen Serinmangel und Dyslipidämie als neue Risikofaktoren für periphere Neuropathie, die therapeutisch genutzt werden können.

Um zu untersuchen, wie Fettleibigkeit und Diabetes den Stoffwechsel von Serin, Glycin und einem Kohlenstoff (SGOC) beeinflussen, haben wir Serin, Glycin und Methionin in verschiedenen Geweben in einem etablierten Mausmodell für krankhafte Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Hyperglykämie (db/db-Mäuse mit Leptinrezeptor-Mangel) quantifiziert auf einem schwarzen Kaliss-Hintergrund (BKS-db/db)) und verglichen die Ergebnisse mit altersentsprechenden Wildtyp-C57BL/6J-Kontrollen. Die db/db-Mäuse zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen eine Verringerung der Leber- und Nieren-Serinspiegel um etwa 30 % (Abb. 1a und erweiterte Daten, Abb. 1a), und die häufiger vorkommenden Glycin-Pools waren in der Leber um 30–50 % reduziert , Niere, inguinales weißes Fettgewebe (iWAT) und Plasma (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 1a – c). Methionin ist über den Ein-Kohlenstoff-Metabolismus mit Serin verbunden und wurde auch in Leber, iWAT und Plasma reduziert (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 1b, c), was darauf hindeutet, dass Diabetes die Serin- und Glycinspiegel in Geweben senkt, die für die Glukose wichtig sind und Lipidhomöostase.

a: Glycin-, Serin- und Methioninspiegel in der Leber von Wildtyp- und BKS-db/db-Mäusen nach 6-stündigem Fasten (n = 6 pro Gruppe). b, Schematische Darstellung der biosynthetischen und katabolischen Wege von Serin und Glycin. Hochregulierte Lebergene in BKS-db/db-Mäusen sind lila und herunterregulierte Gene blau. 10-FormylTHF, 10-Formyltetrahydrofolat; 3-PG, 3-Phosphoglycerat; 5,10-MeTHF, 5,10-Methylentetrahydrofolat; dTMP, Desoxythymidinmonophosphat; f-Met, N-Formylmethionin; PEP, Phosphoenolpyruvat; TCA, Tricarbonsäure; THF, Tetrahydrofolat. c, mRNA-Expression von Leberenzymgenen, die den SGOC-Metabolismus in Wildtyp- und BKS-db/db-Mäusen regulieren (n = 6 pro Gruppe). d, Plasma-Serin-, Glucose-, Glycin- und Methionin-Markierungsfraktion (1 − M0) bei Wildtyp-Mäusen, denen [U-13C3]Serin über eine orale Sonde nach einer Fastennacht über Nacht verabreicht wurde (n = 4 pro Zeitpunkt). e, Gewebe-Glycin-Markierungsfraktion bei Wildtyp-Mäusen 15 Minuten nach der Verabreichung von [U-13C3]Serin über eine orale Sonde (n = 4 pro Gewebe) nach einem Fasten über Nacht. f, Gewebspyruvat-Markierungsfraktion bei Wildtyp-Mäusen 15 Minuten nach der Verabreichung von [U-13C3]Serin über eine orale Sonde (n = 4 pro Gewebe) nach einem Fasten über Nacht. g, Kombiniertes OGTT und STT bei Wildtyp- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe) nach einem Fasten über Nacht. h, STT-AUC in Wildtyp- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). i, Kombiniertes OGTT und STT in Vehikel- (n = 7) und STZ-behandelten (n = 6) C57BL/6J-Mäusen nach einem Fasten über Nacht. j, STT-AUC in Vehikel- (n = 7) und STZ-behandelten (n = 6) C57BL/6J-Mäusen. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung und wurden mithilfe eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests (a,c,h,j) und einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher (g,i) analysiert. Das Schema in Abb. 1b wurde in BioRender erstellt.

Säugetiere beziehen Serin aus der Nahrung, durch De-novo-Synthese aus Glukose und über den Glycin- und Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsel, wobei Leber und Niere als Hauptstandorte für den postprandialen NEAA-Stoffwechsel dienen (Abb. 1b). Um die mechanistischen Grundlagen von reduziertem Leberserin und -glycin in db/db-Mäusen besser zu verstehen, haben wir die Expression von Genen quantifiziert, die mit dem SGOC-Metabolismus nach einem 6-stündigen Fasten assoziiert sind (Abb. 1c). Gene, die Schlüsselenzyme kodieren, die für den Katabolismus oder die Entsorgung von Serin und Ein-Kohlenstoff-Einheiten verantwortlich sind, waren in db/db-Mäusen signifikant hochreguliert, einschließlich Serin-Dehydratase (Sds), Serin-Hydroxymethyltransferase 1 (Shmt1), Shmt2 und 10-Formyltetrahydrofolat-Dehydrogenase (Aldh1l1). Die Expression von zwei Genen, die für Komponenten des Glycin-Spaltungssystems kodieren – Glycin-Decarboxylase (Gldc) und Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (Dld) – war in der db/db-Leber erhöht, wohingegen die Expression von 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (Phgdh) und Methylentetrahydrofolat-Dehydrogenase 2 (Mthfd2) erhöht war ) waren beide signifikant reduziert, was darauf hindeutet, dass die De-novo-Serinsynthese auch bei diabetischen Mäusen eingeschränkt sein könnte. Diese Ergebnisse stimmen mit der Stoffwechselmodellierung im Genommaßstab von Transkriptionsdaten aus der menschlichen Leber von Diabetikern überein17. Die Niere ist ein weiteres Zentrum für den SGOC-Metabolismus18 und die renale Expression von Shmt1 und mehreren Genen, die für Enzyme kodieren, die mit dem Ein-Kohlenstoff-Metabolismus assoziiert sind, war bei db/db-Mäusen erhöht (Extended Data, Abb. 1d).

Zirkadiane und postprandiale Schwankungen der Aminosäuren und der Glukose erschweren die Diagnose von Stoffwechseldefekten. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass ein „Serintoleranztest“ (STT) den SGOC-Metabolismus bei Mäusen besser beurteilen und diejenigen mit erhöhter Serinausscheidung identifizieren könnte. Unter Anwendung ähnlicher Dosierungen wie in klinischen Studien am Menschen (ClinicalTrials.gov: NCT03062449) (400 mg kg−1) verabreichten wir Wildtyp-Mäusen, die über Nacht nüchtern waren, oral Serin und quantifizierten die Plasma-Serin-Pharmakokinetik, um die Dynamik der Serin-Clearance zu messen. Die Werte kehren nach etwa 2 Stunden wieder zum Ausgangswert zurück (Erweiterte Daten, Abb. 1e). Um die Hauptwege zu identifizieren, die an der Serinentsorgung beteiligt sind, verabreichten wir Wildtyp-Mäusen, die über Nacht gefastet hatten, oral [U-13C3]Serin und quantifizierten die Anreicherung nachgeschalteter Metaboliten. Wir beobachteten, dass Glukose während des gesamten Tests in ähnlichem Maße wie Glycin markiert wurde (Abb. 1d) und dass von [U-13C3]Serin abgeleiteter Kohlenstoff signifikant in hepatische Glycin-, Pyruvat- und Citrat-Pools eingebaut wurde (Abb. 1e, f und erweitert). Daten Abb. 1f, g), die zeigen, dass die Glukoneogenese in der Leber in manchen Zusammenhängen ein wichtiger Weg für die Serinentsorgung ist und ihre Regulierung mit Insulin und Glucagon verknüpft, die beide bei db/db-Mäusen erhöht sind (Extended Data Abb. 2a–c). Um zu testen, ob die Insulinresistenz die Serinabsorption und -entsorgung beeinflusst, verabreichten wir über Nacht nüchternen Wildtyp- und db/db-Mäusen sowohl Glucose (2 g kg−1) als auch Serin (400 mg kg−1). Wir beobachteten trotz der verabreichten höheren Dosis eine signifikante Verringerung der STT-Fläche unter der Kurve (AUC) bei db/db-Mäusen (Abb. 1g, h und erweiterte Daten Abb. 2d). Bemerkenswert ist, dass die akute Serinbelastung im Wesentlichen keinen Einfluss auf die zirkulierenden Glycinkonzentrationen hatte (Extended Data, Abb. 2e), obwohl Hinweise auf eine schnelle gegenseitige Umwandlung vorliegen (Abb. 1d, e). Umgekehrt gab es keine Unterschiede in der STT-AUC zwischen Wildtyp- und db/db-Mäusen, wenn Serin ohne Glucose verabreicht wurde (Extended Data, Abb. 2f).

Um festzustellen, ob eine erhöhte Serinausscheidung spezifisch für db/db-Mäuse mit Leptinrezeptor-Mangel ist oder allgemeiner auf eine beeinträchtigte Insulinsignalisierung zurückzuführen ist, behandelten wir C57BL/6J-Mäuse mit Vehikel oder Streptozotocin (STZ), um Insulinmangel, Hyperglykämie und Fettabbau auszulösen ( Erweiterte Daten Abb. 2g–i). Plasmaglycin und verzweigtkettige Aminosäuren (jedoch nicht Serin) waren eine Woche nach der STZ-Behandlung verändert (Extended Data Abb. 2j). Zwei Wochen nach der Injektion zeigte die gleichzeitige Verabreichung von Glucose und Serin bei STZ-diabetischen Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen eine erhöhte Serinausscheidung (Abb. 1i, j und Extended Data Abb. 2k), was darauf hindeutet, dass sowohl eine Insulinresistenz als auch ein Insulinmangel zu einer verminderten Durchblutung beitragen können Serin bei diabetischen Mäusen.

Klinische Studien haben gezeigt, dass ein Serinmangel an der Regulierung von Makulaerkrankungen und peripherer Neuropathie beteiligt ist15,16. Angesichts der beeinträchtigten Serinhomöostase bei db/db-Mäusen bestätigten wir als nächstes, dass in diesem Modell ein abweichender Serinstoffwechsel mit einer peripheren Neuropathie einhergeht. Vierzehn Wochen alte db/db-Mäuse zeigten thermische und taktile Hypoalgesie sowie eine verringerte motorische Nervenleitungsgeschwindigkeit (MNCV) (Extended Data Abb. 2l – n). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine fehlerhafte Serinhomöostase mit diabetischer peripherer Neuropathie verbunden ist.

Die Einschränkung von Serin und Glycin wird häufig zur Regulierung der Gesundheitsergebnisse bei Mäusen eingesetzt und wird mehrere Monate lang relativ gut vertragen16,19,20,21,22. Um die Auswirkung eines systemischen Serinmangels im Zusammenhang mit ernährungsbedingter Fettleibigkeit zu modellieren, fütterten wir Mäuse mit fettarmen (10 % kcal) (LFD) oder fettreichen (60 % kcal aus Fett) (HFD) Diäten und verglichen ihre Phänotypen an Mäuse, denen isonitrogene Diäten ohne Serin und Glycin (−SG LFD oder −SG HFD) verabreicht wurden (Ergänzungstabelle 1). Beide −SG-Diäten reduzierten effektiv den zirkulierenden und hepatischen Serin- und Glycingehalt im gefütterten Zustand, jedoch nicht im nüchternen Zustand (Abb. 2a, b und erweiterte Daten Abb. 3a, b). Die HFD allein senkte den Glycinspiegel in der Leber, jedoch in geringerem Maße als der Entzug von Serin und Glycin über die Nahrung (Erweiterte Daten, Abb. 3b). Andere von Serin und Glycin abgeleitete Lebermetaboliten, einschließlich Glutathion, wurden von ihrer Einschränkung nicht stark beeinflusst (Extended Data, Abb. 3b). Bemerkenswert ist, dass die durch HFD verursachte Gewichtszunahme durch eine Serin- und Glycinrestriktion in der Nahrung abgeschwächt wurde, während Nahrung, Kalorien- und Wasseraufnahme, Kalorienabsorption und körperliche Aktivität unbeeinflusst blieben (Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 3c – h). Mithilfe der Echo-Magnetresonanztomographie (EchoMRT) quantifizierten wir die Muskelmasse und die Fettmasse in allen Gruppen und stellten fest, dass eine Serinrestriktion in der Nahrung die Fettmasse signifikant reduzierte, jedoch im Vergleich zur HFD-Gruppe keinen Einfluss auf die Muskelmasse hatte (Abb. 2d). In Übereinstimmung mit diesen Veränderungen der Adipositas beobachteten wir, dass die HFD-Fütterung zunahm, während die Serin- und Glycinrestriktion abnahm, und die Größe der weißen Adipozyten im Nebenhoden (Extended Data, Abb. 3i).

a, Plasma-Serinspiegel bei gefütterten und über Nacht nüchternen Mäusen, die 18 Wochen lang mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD gefüttert wurden (n = 10 pro Gruppe). b, Plasma-Glycinspiegel bei Mäusen, die 18 Wochen lang mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD gefüttert wurden (n = 10 pro Gruppe). c, Körpergewicht von Mäusen, die mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD gefüttert wurden (n = 13 pro Gruppe). d, Körperzusammensetzung bei Mäusen 18 Wochen nach der Fütterung mit LFD (n = 10), −SG LFD (n = 12), HFD (n = 13) oder −SG HFD (n = 13). e, Glukosetoleranztest (GTT) AUC 18 Wochen nach der Fütterung mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD (n = 13 pro Gruppe). f, Insulintoleranztest (ITT) AUC 18 Wochen nach der Fütterung mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD (n = 15 pro Gruppe). g, Phylogenetische Alpha-Diversität bei Mäusen, die mit LFD, −SG LFD, HFD oder −SG HFD gefüttert wurden (n = 10 pro Gruppe). h, logarithmischer Anteil der Arten aus dem Fettsäuresyntheseweg bei Mäusen, die 18 Wochen lang mit LFD (n = 10), −SG LFD (n = 10), HFD (n = 9) oder −SG HFD (n = 9) gefüttert wurden . i, Hepatische De-novo-Palmitatsynthese bei Mäusen, die 18 Wochen lang mit LFD (n = 3), −SG LFD (n = 4), HFD (n = 5) oder −SG HFD (n = 5) gefüttert wurden. j, Wärmesensorik bei Mäusen, die mit LFD (n = 15), −SG LFD (n = 15), HFD (n = 14) oder −SG HFD (n = 15 pro Gruppe) gefüttert wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung sowie Minimum und Maximum (g, h) und wurden mithilfe einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher (a–j) analysiert.

Um festzustellen, wie die Fütterung mit −SG HFD die Glukosehomöostase beeinflusst, haben wir Mäuse mithilfe von Standard-GTTs und ITTs analysiert. Während −SG HFD die Fettleibigkeit abschwächte, blieben die Mäuse Glukose- und Insulinintoleranz (Abb. 2e, f und erweiterte Daten Abb. 3j, k), was darauf hindeutet, dass die Serin- und Glycinrestriktion und die daraus resultierende Verringerung der Adipositas eine HFD-induzierte Glukoseintoleranz nicht verhindern und Insulinresistenz. Um zu testen, ob eine veränderte systemische Substratverwertung von Kohlenhydraten gegenüber Lipiden die Veränderungen in der Adipositas verursacht, setzten wir Mäuse, die jede Diät 18 Wochen lang konsumiert hatten, in Stoffwechselkäfige und quantifizierten das respiratorische Austauschverhältnis (RER). Während die HFD die RER erwartungsgemäß veränderte, wurden bei einer Serin/Glycin-Einschränkung in der Nahrung keine Veränderungen beobachtet (Erweiterte Daten, Abb. 3l).

Als nächstes führten wir eine metagenomische Analyse der fäkalen Mikrobiota durch, um zu verstehen, wie sich die oben genannten Diäten auf die Zusammensetzung und Diversität des Mikrobioms auswirkten, die mit Ernährungsdefiziten korrelieren und diese abfedern können23. Eine anhaltende HFD- oder −SG-HFD-Fütterung verringerte die phylogenetische Alpha-Diversität im Vergleich zu mit LFD gefütterten Mäusen, während die −SG-LFD-Fütterung die Alpha-Diversität erhöhte (Abb. 2g). Umgekehrt ergab die PERMANOVA-Untersuchung der Aitchison-Abstände anhand einer robusten Hauptkomponentenanalyse signifikante Beta-Diversitätsunterschiede zwischen mit −SG HFD gefütterten Mäusen und anderen Gruppen, was die deutliche Wirkung dieser kohlenhydratarmen, fettreichen, Serin- und Glycin-beschränkten Ernährung auf die Mäuse hervorhebt das fäkale Mikrobiom (Extended Data Abb. 4a). Darüber hinaus wurden die logarithmischen Verhältnisse von Mikroorganismenstämmen, die vollständige Serinbiosynthese- und Glycinspaltungswege exprimieren, um −SG HFD erhöht bzw. verringert (Extended Data Abb. 4b, c), und diese Diät verringerte das logarithmische Verhältnis von Stämmen, die eine vollständige Serinbiosynthese und Glycinspaltungswege exprimieren Fettsäuresyntheseweg (Abb. 2h). Die wichtigsten Stämme mit den stärksten Veränderungen sind in der erweiterten Datenabbildung 4d aufgeführt. Bemerkenswert ist, dass die −SG-LFD-Fütterung die Stämme nicht auf diese Weise modulierte, vermutlich aufgrund des höheren Kohlenhydratgehalts, der die Serinsynthese erleichtern könnte.

Um direkt zu untersuchen, wie sich ein Serinmangel auf die Lipogenese in der Leber auswirkt, wurde Mäusen, die 18 Wochen lang mit den oben genannten Diäten gefüttert wurden, 18 Stunden lang schweres Wasser (D2O) verabreicht und Lipide wurden zur Quantifizierung der Isotopenanreicherung, der molaren Häufigkeit und der Synthese extrahiert24. Die Einschränkung von Serin und Glycin in der Nahrung reduzierte die Palmitatsynthese in der Leber im Vergleich zu Kontrolldiäten mit hohem Seringehalt deutlich um etwa 70 % (Abb. 2i und erweiterte Daten, Abb. 5a). Die hepatische Cholesterinsynthese war bei −SG HFD im Vergleich zu HFD erhöht (Extended Data Abb. 5b). In Übereinstimmung mit diesen Veränderungen wurde die hepatische Expression von ATP-Citrat-Lyase (ACLY), Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC2) und Stearoyl-CoA-Desaturase (SCD1) durch diätetische Serinrestriktion stark reduziert (etwa 50 %), wohingegen die Expression der Cholesterinbiosynthese stark reduziert wurde Enzyme blieben unverändert oder erhöht (Extended Data Abb. 5c – e). Veränderungen in der AKT-Phosphorylierung bei Ser473 und Thr308 korrelierten eher mit dem Fett- und Kohlenhydratgehalt der Nahrung als mit den Serin- und Glycinspiegeln, was weiter darauf hindeutet, dass die Serinrestriktion Veränderungen im Fettsäurestoffwechsel hervorruft, die unabhängig von der Insulinsignalisierung sind (Extended Data, Abb. 5c).

Systemischer Serinmangel wurde kürzlich mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht16,25,26,27,28. Menschen mit Diabetes, die über eine erhöhte Serinausscheidung verfügen, könnten daher anfälliger für neurologische Komorbiditäten wie eine Serin-assoziierte periphere Neuropathie sein. Um festzustellen, ob ein langfristiger chronischer Serinmangel ausreicht, um eine periphere Neuropathie auszulösen, haben wir Mäuse bis zu 12 Monate lang entweder mit Kontrollfutter oder Serin- und Glycin-freiem Futter (19,2 % der Energie aus Fett) gefüttert. Die zeitliche Quantifizierung der thermischen Reaktion auf Hitze ergab ein Fortschreiten der Hypoalgesie nach 12 Monaten diätetischer Intervention (Extended Data Abb. 6a), was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt16. Zu diesem Zeitpunkt stellten wir auch eine verringerte intraepidermale Nervenfaserdichte (IENF) in der Pfotenhaut fest (Extended Data Abb. 6b), was ebenfalls ein klinisches Maß für die Degeneration kleiner sensorischer Fasern ist29. Bemerkenswert ist, dass Mäuse, denen −SG HFD nur drei Monate lang verabreicht wurde, eine ausgeprägte thermische Hypoalgesie zeigten (Abb. 2j), was darauf hindeutet, dass eine Kombination aus niedrigem systemischem Serin und HFD das Auftreten einer peripheren Neuropathie bei Mäusen beschleunigt.

Serin ist essentiell für die Biosynthese kanonischer Sphingolipide, die im Nervensystem angereichert werden. Wenn Serin knapp wird, baut Serin-Palmitoyltransferase (SPT) andere Aminosäuren, einschließlich Alanin, ein, um nicht-kanonische Desoxysphingolipide zu bilden30,31. Angesichts der Bedeutung von kanonischen Ceramiden und 1-Desoxy(dihydro)ceramiden bei Fettleibigkeit bzw. Neuropathie15,32 stellten wir die Hypothese auf, dass die SPT-Hemmung die beobachteten Phänotypen von Fettleibigkeit und Neuropathie beeinflussen könnte. Wir verabreichten daher Mäusen, die 6 Monate lang mit den oben genannten Diäten gefüttert wurden, Myriocin (0,3 mg kg-1 jeden zweiten Tag), einen SPT-Inhibitor, oder ein Vehikel und quantifizierten die Sphingolipid-Diversität und die thermische Wahrnehmung. In Übereinstimmung mit früheren Berichten 32 schwächte die Behandlung mit Myriocin die HFD-induzierte Gewichtszunahme ab, ohne die Serin- und Glycinspiegel im Plasma zu beeinflussen (Erweiterte Daten, Abb. 6c – f). Myriocin milderte jedoch auch die thermische Hypoalgesie, die bei Mäusen auftrat, denen −SG HFD verabreicht wurde (Abb. 3a), was darauf hindeutet dass eine Verringerung der SPT-Aktivität die Serin-assoziierte periphere Neuropathie verringerte.

a, Thermische Latenz bei Mäusen, die mit LFD plus Vehikel (veh) (n = 10), LFD plus 0,3 mg kg−1 Myriocin (myr) (n = 10), −SG LFD plus Vehikel (n = 10), −SG gefüttert wurden LFD plus Myriocin (n = 9), HFD plus Vehikel (n = 10), HFD plus Myriocin (n = 10), −SG HFD plus Vehikel (n = 10) oder −SG HFD plus Myriocin (n = 9). b, Stapeldiagramm von Leber-DesoxyDHCer bei Mäusen, die mit LFD plus Vehikel (n = 10), LFD plus Myriocin (n = 10), −SG LFD plus Vehikel (n = 10), −SG LFD plus Myriocin (n = 9) gefüttert wurden. , HFD plus Vehikel (n = 10), HFD plus Myriocin (n = 10), −SG HFD plus Vehikel (n = 10) oder −SG HFD plus Myriocin (n = 9). c, Verlauf der thermischen Latenzzeit bei Mäusen, die mit LFD plus Vehikel (n = 12), HFD plus Vehikel (n = 12), −SG HFD plus Vehikel (n = 12) oder −SG HFD plus Myriocin (n = 11) gefüttert wurden. d, IENF-Dichte bei Mäusen, die mit LFD plus Vehikel (n = 10), HFD plus Vehikel (n = 7), −SG HFD plus Vehikel (n = 12) oder −SG HFD plus Myriocin (n = 8) gefüttert wurden. e, Pfotenhaut-DesoxyDHCer-Verteilung bei Mäusen, die mit LFD plus Vehikel (n = 12), HFD plus Vehikel (n = 12), −SG HFD plus Vehikel (n = 12) oder −SG HFD plus Myriocin (n = 11) gefüttert wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung und wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher (a, b, d, e) oder einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher (c) analysiert. Statistische Analysen in b,e wurden unter Verwendung summierter DesoxyDHCer-Häufigkeiten durchgeführt.

Um die metabolischen Treiber dieses Phänotyps der peripheren Neuropathie besser zu verstehen, haben wir als Nächstes Ceramide und Desoxydihydroceramide (DesoxyDHCer) in Leber und Ischiasnerv quantifiziert. Die Beschränkung von Serin und Glycin erhöhte DesoxyDHCer in LFD- und HFD-Einstellungen und reduzierte kanonische Ceramide im HFD-Hintergrund, wohingegen Myriocin im Allgemeinen die Häufigkeit von Sphingolipiden verringerte (Abb. 3b und erweiterte Daten Abb. 6g – i). Im Gegensatz dazu waren die Ceramid- und 1-Desoxysphingolipid-Spiegel unverändert oder korrelierten nicht mit dem Phänotyp der peripheren Neuropathie im Ischiasnerv, was möglicherweise auf die großen Lipidablagerungen im Myelin zurückzuführen ist (Extended Data Abb. 6h, i). Bemerkenswert ist, dass die Serinrestriktion vor einem LFD-Hintergrund nach sechs Monaten keine thermische Hypoalgesie hervorrief (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Akkumulation von 1-Desoxysphingolipid allein nicht ausreicht, um diesen Phänotyp voranzutreiben, und im Einklang mit aktuellen Berichten über ein Sptlc1C133W-Mausmodell steht33. Als nächstes haben wir die IENF-Dichte, die Hornhautnervendichte und die Gewebelipide in einer separaten Kohorte von Mäusen gemessen, denen sechs Monate lang LFD, HFD, −SG HFD oder −SG HFD plus Myriocin verabreicht wurde. Myriocin linderte das Auftreten einer thermischen Hypoalgesie bei Mäusen, denen −SG HFD verabreicht wurde (Abb. 3c), und diese Behandlung schützte auch die Dichte kleiner Fasernerven in der Epidermis und Hornhaut (Abb. 3d und erweiterte Daten Abb. 7a, b), ohne die taktile Wahrnehmung zu beeinträchtigen oder MNCV (Extended Data Abb. 7c, d), was darauf hindeutet, dass dieser früh einsetzende Phänotyp im Gegensatz zu anderen Knoten im Sphingolipid-Metabolismus spezifisch für kleine sensorische Fasern und 1-Desoxysphingolipide ist34. Mit −SG HFD gefütterte Mäuse zeigten erhöhte hepatische 1-Desoxysphingolipide und Sphingomyelin, wohingegen Myriocin die Spiegel von Sphingolipiden sowie Triglyceriden und Diacylglyceriden stark reduzierte (Extended Data Abb. 7e), was die pleiotropen Wirkungen dieses Moleküls auf das Lipidom weiter hervorhebt 32, 35. Schließlich zeigte die Pfotenhaut einen signifikanten Anstieg von DesoxyDHCer, der durch die Myriocin-Behandlung reduziert wurde (Abb. 3e), was darauf hindeutet, dass die Lipid-Mikroumgebung, die kleine Fasern umgibt, die sensorische Funktion beeinflussen kann.

Als nächstes untersuchten wir, ob die Unterdrückung der SPT-Aktivität die Neuropathie bei db/db-Mäusen lindern könnte, die eine erhöhte zirkulierende DeoxySA sowie erhöhte Leberceramide und DeoxyDHCer aufweisen (Extended Data Abb. 8a, b). In Übereinstimmung mit den Ergebnissen des −SG HFD-Diät-induzierten peripheren Neuropathiemodells verhinderte die Verabreichung von Myriocin im Alter von sechs Wochen das Fortschreiten der thermischen Hypoalgesie und stellte das Tastempfinden bei db/db-Mäusen wieder her (Extended Data Abb. 8c, d). Die IENF-Dichte war auch bei db/db-Mäusen erhöht, denen acht Wochen lang Myriocin verabreicht wurde (Extended Data, Abb. 8e). Obwohl Myriocin keinen Einfluss auf die Körpergewichtszunahme, Hyperglykämie oder den Serinspiegel im Plasma hatte (Erweiterte Daten, Abb. 8f–h), reduzierte es die kanonischen Sphingolipide in der Leber stark, zeigte jedoch begrenzte Auswirkungen auf die 1-Desoxysphingolipide und Ceramide der Pfotenhaut (Erweiterte Daten, Abb. 8i). -N). Daher wirkt Myriocin wahrscheinlich sowohl über direkte als auch indirekte Mechanismen auf die Leber und andere Gewebe, was auch für seine Toxizität verantwortlich ist35.

In Anbetracht des chronischen Serinmangels, den diabetische Mäuse aufweisen, fütterten wir db/db-Mäuse ab einem Alter von 6 Wochen mit einer mit 3 % Serin angereicherten Diät und quantifizierten die Phänotypen der Neuropathie. Das thermische Empfinden wurde im Alter von 6, 10 und 14 Wochen und das taktile Empfinden zum Zeitpunkt der Tötung gemessen. Zu diesem Zeitpunkt zeigten die Mäuse erhöhte Plasma- und Leber-Serin-, aber keine Glycin-Spiegel (Abb. 4a, b). Wir beobachteten in dieser Kohorte keine Veränderung des Körpergewichts und einen leichten Anstieg des zirkulierenden Glukosespiegels (Extended Data Abb. 9a,b). Bei Mäusen, denen diese mit Serin angereicherte Diät verabreicht wurde, waren jedoch sowohl die thermische als auch die taktile Hypoalgesie verringert (Abb. 4c, d). Bemerkenswert ist, dass in allen Geweben keine Veränderung der kanonischen Sphingolipide beobachtet wurde, die 1-Desoxysphingolipide jedoch sowohl in der Leber als auch in der Pfotenhaut stark verringert waren (Abb. 4e, f und erweiterte Daten Abb. 9c – f). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass eine Serinergänzung das Fortschreiten der diabetischen peripheren Neuropathie verlangsamen kann.

a, Plasma-Aminosäurespiegel im gefütterten Zustand bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontrolldiät (n = 8) oder einer mit Serin angereicherten Diät (n = 9) gefüttert wurden. b, Aminosäuregehalt der Leber im gefütterten Zustand bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder mit Serin angereicherten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). c: Zeitverlauf der thermischen Latenz bei BKS-db/db-Mäusen, die entweder mit einer Kontrolldiät (n = 8) oder einer mit Serin ergänzten Diät (n = 9) gefüttert wurden. d, Taktile Wahrnehmung 8 Wochen nach der Fütterung von BKS-db/db-Mäusen entweder mit einer Kontrolldiät (n = 8) oder einer mit Serin angereicherten Diät (n = 9). e, DesoxyDHCer-Spiegel in der Leber von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder mit Serin angereicherten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). f, DesoxyDHCer-Spiegel in der Pfotenhaut von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder Serin-ergänzten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM und wurden mithilfe eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests (a, b, d–f) oder einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem Post-hoc-Test mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher (c) analysiert. Statistische Analysen in e,f wurden unter Verwendung summierter DesoxyDHCer-Häufigkeiten durchgeführt.

Hier beschreiben wir, wie die direkte oder indirekte Induktion eines chronischen systemischen Serinmangels die Lipidhomöostase verändert und zur diabetischen peripheren Neuropathie beiträgt. Die Modulation der Dyslipidämie mit Myriocin oder der 1-Desoxysphingolipid-Biosynthese mit Serin-Supplementierung lindert sowohl die thermische als auch die taktile Hypoalgesie bei adipösen diabetischen Mäusen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, wie ein Serinmangel mit Dyslipidämie synergetisch wirken kann, um neurologische Phänotypen sowohl im Zusammenhang mit seltenen Krankheiten16,25,26 als auch indirekt über eine weit verbreitete chronische Krankheit wie Typ-2-Diabetes zu verändern, wo er sich als Komorbidität manifestiert, die bei einer Untergruppe von Patienten auftritt Patienten. Eine verminderte Zirkulation von Serin und Glycin bei diabetischen Mäusen kann durch einen erhöhten Fluss durch Gluconeogenese, Ein-Kohlenstoff-Metabolismus, renale Retention18,36 und/oder Entsorgung als Acylglycine37 verursacht werden, die auch durch Dyslipidämie beeinflusst werden38.

Ein STT, analog zu einem oralen Glukosetoleranztest (OGTT), könnte Patienten identifizieren, die eine erhöhte postprandiale Serinausscheidung aufweisen und möglicherweise besonders anfällig für sensorische Neuropathie sind. Die Normalisierung des zirkulierenden Serinspiegels durch Nahrungsergänzung verzögert den Beginn und das Fortschreiten der sensorischen Neuropathie bei db/db-Mäusen. Tatsächlich verbessert die Ergänzung von Serin und B-Vitaminen die periphere Neuropathie in einigen präklinischen Modellen und steht im Mittelpunkt klinischer Studien für verschiedene neurodegenerative Erkrankungen39,40,41 (ClinicalTrials.gov: NCT03062449). Unsere Ergebnisse verdeutlichen physiologisch relevante molekulare Zusammenhänge zwischen der Serin- und Glycin-Homöostase, dem Sphingolipid-Metabolismus und diabetischen Komorbiditäten. Die metabolischen und neuropathischen Phänotypen von Mausmodellen für Diabetes und Fettleibigkeit variieren je nach Stamm und Genotyp42,43, und C57BL6/J-Mäuse reagieren aufgrund von Mutationen in Nnt44 und anderen Genen besonders empfindlich auf die metabolischen Folgen von HFD. Unsere Daten sowohl bei diabetischen db/db-Mäusen als auch bei C57BL/6J-Mäusen, denen −SG HFD verabreicht wurde, zeigen jedoch, dass Serinmangel in Kombination mit Dyslipidämie bei unterschiedlichen genetischen Hintergründen zu peripherer Neuropathie führen kann.

Es bleiben einige wichtige Fragen offen, darunter die Frage, warum ein Mangel an Serin und Glycin die Synthese von Leberfettsäuren und die Genexpression in der Leber unterdrückt. Darüber hinaus tragen verschiedene Sphingolipid-Spezies und/oder deren Fehllokalisation zur Neuropathie bei21,45,46,47,48, ihre genauen Toxizitätsmechanismen bleiben jedoch unklar. Wir haben ein Ernährungsmodell der Serin-assoziierten sensorischen Neuropathie entwickelt und validiert, das innerhalb von drei Monaten einen Phänotyp entwickelt, der dabei helfen könnte, zu verstehen, wie neurotoxische Dyslipidämie behandelt werden kann. Verschiedene genetische Veränderungen können das zirkulierende Serin und Glycin beeinflussen, einschließlich häufiger Einzelnukleotidpolymorphismen und seltener Kodierungsereignisse25,28,49, oder solche Mängel könnten durch Diabetes-induzierten neu verdrahteten Leberstoffwechsel induziert werden. Somit erweist sich ein systemischer Serinmangel als Modifikator für alters- und diabetesbedingte Neuropathien, da er sowohl die Sphingolipidvielfalt verändert als auch die Fähigkeit der Leber beeinträchtigt, mit einer Lipidüberladung in der Nahrung umzugehen.

Alle Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit dem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of California, San Diego und dem Salk Institute for Biological Studies genehmigt und durchgeführt. Die Mäuse wurden im selben Raum gehalten, wobei sichergestellt wurde, dass sie der gleichen Temperatur (21 °C), Luftfeuchtigkeit (Umgebungsfeuchtigkeit 65 %) und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus (06:00–18:00 Uhr) ausgesetzt waren. In Abb. 1: 14 bis 16 Wochen alte C57BL/6J- (JAX 000664) oder BKS-db/db-Mäuse (JAX 000642) und 10 bis 12 Wochen alte, mit Vehikel oder STZ behandelte C57BL/6J (JAX 000664) Mäuse wurden vor der Gewebeentnahme 6 Stunden lang gefastet. Die Tiere wurden mit Isofluran betäubt, enthauptet und die Gewebe schnell mit Wollenberger-Klammern gesammelt, auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff vorgekühlt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Für Abb. 2 wurden 8 Wochen alte C57BL/6J (JAX 000664) mit Futter von Envigo gefüttert. Die Zusammensetzung der Nahrung ist in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt. In Ernährungsexperimenten wurden die Gewebe zwischen 07:00 und 10:00 Uhr entnommen, d. h. im gefütterten Zustand, sofern nicht anders angegeben. Von einer separaten Tierkohorte wurden 18 Wochen nach der diätetischen Intervention Plasmaproben im gefütterten (07:00–10:00 Uhr) und nüchternen Zustand (18 Stunden Fasten über Nacht) entnommen. In Experimenten mit db/db-Mäusen wurden Gewebe nach 6-stündigem Fasten gesammelt. Für Abb. 3 wurden 8 Wochen alte C57BL/6J (JAX 000664) mit Futter von Envigo gefüttert. Die Gewebeentnahme erfolgte zwischen 07:00 und 10:00 Uhr. Die Tiere wurden mit Isofluran betäubt, enthauptet und die Gewebe schnell mit Wollenberger-Klammern gesammelt, auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff vorgekühlt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Für Abb. 4 wurden 6 Wochen alte BKS-db/db-Mäuse (JAX 000642) über einen Zeitraum von 8 Wochen entweder mit einer Kontroll- oder mit Serin angereicherten Diät (von Envigo) gefüttert. Sofern nicht anders angegeben, fand die Gewebeentnahme zwischen 07:00 und 10:00 Uhr statt. Die Tiere wurden mit Isofluran anästhesiert, enthauptet und die Gewebe schnell mit Wollenberger-Klammern gesammelt, auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff vorgekühlt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert.

Altersentsprechende 14 bis 16 Wochen alte Wildtyp- und BKS-db/db-Mäuse sowie 10 bis 12 Wochen alte, mit Vehikel und STZ behandelte C57BL/6J-Mäuse (JAX 000664) wurden über Nacht mit Wasserzugang fasten gelassen nach Belieben zur Verfügung gestellt. Für eine STT wurden die Tiere gewogen und Serin und/oder Glucose wurden über eine orale Sonde in einer Dosis von 400 mg kg-1 bzw. 2 g kg-1 verabreicht, wobei Blutproben aus der Schwanzspitze in EDTA-beschichteten Mikrovettenröhrchen gesammelt wurden ( Sarstedt) vor und 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten nach einer oralen Sondenernährung. EDTA-Mikrovetten wurden 5 Minuten lang bei 4 °C und 2.000 g zentrifugiert, um Plasma zu erhalten, und die Proben wurden bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Die Blutzucker- und Serinkonzentrationen wurden mit dem Contour Next-Glukometer (Bayer) bzw. der Gaschromatographie-Massenspektrometrie wie unten beschrieben quantifiziert. Die Plasma-Serin-Pharmakokinetik wurde für eine Dosis von 400 mg kg-1 mit dem PK-Solver50 bestimmt.

Um den späteren Verbleib von Serin zu bestimmen, ließ man Wildtyp-Mäuse über Nacht fasten, wog sie am Morgen und verabreichte [U-13C3]Serin per oraler Sondenernährung in einer Dosis von 400 mg kg−1, wobei die Gewebe mit Wollenberger-Klemmen vorab entnommen wurden. Vor und 15, 30, 45, 60 und 120 Minuten nach der oralen Sondenernährung auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff abgekühlt und die Proben bis zur Analyse bei –80 ° C gelagert.

Im Handel erhältliche Kits wurden zur Bestimmung von Seruminsulin (Mouse Insulin ELISA 10-1247-01, Mercodia) und Glucagon (Glucagon ELISA 10-1271-01, Mercodia) nach einem 6-stündigen Fasten bei Mäusen gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

C57BL/6J-Mäusen, die 18 Wochen lang mit Futter gefüttert wurden, wurde D2O (in 0,9 % NaCl) in einer Dosis von 0,027 ml pro g Körpergewicht intraperitoneal injiziert, wobei das Trinkwasser über einen Zeitraum von ca. 18 Stunden durch eine mit 6 % D2O angereicherte Lösung ersetzt wurde. Am Morgen (07:00–10:00 Uhr) wurden die Gewebe schnell mit Wollenberger-Klammern gesammelt, auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff vorgekühlt und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert.

Die Plasma-D2O-Anreicherung wurde mithilfe des Deuterium-Aceton-Austauschprotokolls wie zuvor beschrieben24 bestimmt. Kurz gesagt, 5 µl Plasma wurden mit 4 µl 5 %iger Aceton-in-Acetonitril-Lösung und 4 µl 10 M NaOH 24 Stunden lang inkubiert. Als nächstes wurden 500 mg Na2SO4 und 600 µl Chloroform zugegeben und die Proben vortexiert. Nach 2-minütiger Zentrifugation bei 3.000 g wurden 80 µl dreifach in Fläschchen mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) überführt und die Plasma-D2O-Anreicherung anhand einer externen Standardkurve auf einer Agilent DB-35MS-Säule (30 m x 0,25) quantifiziert mm Innendurchmesser × 0,25 μm, Agilent J&W Scientific), installiert in einem Agilent 7890 A Gaschromatographen (GC), verbunden mit einem Agilent 5975 C Massenspektrometer, mit folgendem Temperaturprogramm: 60 °C anfänglich, Erhöhung um 20 °C min−1 to 100 °C, um 50 °C min−1 auf 220 °C erhöhen und 1 Minute halten.

Um die D2O-Markierung im Gewebe zu quantifizieren, wurden ca. 20 mg gefrorenes Gewebe mit 250 µl –20 °C Methanol, 250 µl eiskalter Kochsalzlösung und 500 µl –20 °C Chloroform, versetzt mit internen Standards Palmitat-d31 (Cambridge Isotope Laboratories, DLM), homogenisiert -215-PK) und Coprostanol (Sigma, 7578). Nach einem 5-minütigen Zentrifugieren bei 4 °C und 21.000 g wurde die Chloroformfraktion gesammelt, getrocknet und mit 500 µl 2 % H2SO4 in Methanol für 2 Stunden bei 50 °C resuspendiert. Als nächstes wurden 100 µl gesättigtes NaCl und 500 µl Hexan zugegeben, die Proben mit einem Vortex gemischt und die obere Hexanphase gesammelt und in ein GC-MS-Fläschchen überführt. Fettsäuremethylester wurden mithilfe einer Select FAME-Säule (100 m × 0,25 mm Innendurchmesser) analysiert, die in einem Agilent 7890 A GC mit Schnittstelle zu einem Agilent 5975 C MS installiert war, und zwar unter Verwendung des folgenden Temperaturprogramms: 80 °C anfänglich, Erhöhung um 20 °C min−1 auf 170 °C, um 1 °C erhöhen min−1 auf 204 °C, dann 20 °C min−1 auf 250 °C und 10 min halten. Die prozentuale Isotopologenverteilung jeder Fettsäure und jedes polaren Metaboliten wurde mithilfe interner Algorithmen, die aus einem früheren Bericht übernommen wurden, ermittelt und hinsichtlich der natürlichen Häufigkeit korrigiert51.

Für GTT und ITT wurden C57BL/6J-Mäuse, die 18 Wochen lang mit der Nahrung gefüttert wurden, über Nacht mit Wasser nach Belieben gefastet. Am Morgen wurden die Tiere gewogen und der Nüchternblutzucker anhand einer Schwanzblutung mit einem Contour Next-Glukometer (Bayer) bestimmt. Für die GTT wurde den Tieren ein Glukosebolus in einer Dosis von 2 g/kg Körpergewicht intraperitoneal injiziert und der Blutzucker 15, 30, 60, 120 und 180 Minuten nach der Injektion bestimmt. Für die ITT wurde den Tieren intraperitoneal ein Insulinbolus (100 I.E. ml–1 Humulininsulin, Eli Lilly) in einer Dosis von 0,5 I.E. kg–1 injiziert, und der Blutzucker wurde 15, 30, 60 und 90 Minuten danach quantifiziert -Injektion wie zuvor beschrieben52.

Die Muskel- und Fettmasse wurde mit einem EchoMRI 3-in-1-Instrument (quantitatives Kernspinresonanz-Bildgebungssystem (qNMR)) bestimmt. Das Comprehensive Laboratory Animal Monitoring System (CLAMS) (Oxymax, Columbus Instruments) wurde verwendet, um die systemischen Stoffwechselraten bei einzeln gehaltenen Mäusen über einen Zeitraum von 6 Tagen zu quantifizieren. Wasser-, Futter- und Kalorienaufnahme wurden für einzeln gehaltene Tiere über einen Zeitraum von 6 Tagen berechnet, wenn sie CLAMS ausgesetzt waren. Der Sauerstoffverbrauch des gesamten Körpers (VO2) und die Kohlendioxidrate (VCO2) wurden auf das entsprechende Gesamtkörpergewicht normalisiert, und der RER wurde als Verhältnis von VCO2 zu VO2 berechnet.

Ungefähr 1 g Kot wurde über Nacht getrocknet und mit Mörser und Stößel zermahlen. Die pulverisierte Probe wurde mit 300 µl ddH2O zu einem Pellet rekonstituiert und gewogen. Das Pellet wurde in einen Bombenzylinder gegeben, der von 2.000 ml ddH2O umgeben war (Parr 6100 Compensated Jacket Calorimeter). Die durch die Verbrennung erzeugte Wärme wurde anhand der Änderung der Wassertemperatur gemessen. Das Kalorimeter-Energieäquivalent W (Cal °C−1) wurde mit standardisierter Benzoesäure berechnet. Der Endenergiegehalt jedes Pellets wurde wie folgt berechnet:

Die Kalorienaufnahme wurde berechnet, indem die Bruttoenergie (Kalorienextraktion im Stuhl) von der Kalorienaufnahme abgezogen wurde.

DNA wurde mit dem MoBio PowerFecal DNA-Isolierungskit (12830-50) aus 10–30 mg Stuhl extrahiert. Die extrahierte DNA wurde mit einem Nanodrop (ThermoFisher Scientific) quantifiziert. Die Rohdaten der Gesamtgenomsequenzierung wurden auf Qiita53 hochgeladen, wo wir dem Standardverarbeitungsworkflow folgten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Rohlesevorgänge mithilfe der automatischen Erkennungsparameter in Fastp-Version 2054 adaptergefiltert und mithilfe von Minimap2-Version 2.1755 host- (maus)gefiltert wurden. Die resultierenden Sequenzen wurden mit Bowtie 2 Version 2.4.256 über die Web of Life Toolkit App (https://github.com/qiyunzhu/woltka) mit der Web of Life (WoL)-Referenzdatenbank57 abgeglichen; Dieser Schritt generierte Tabellen für Gattung, Art, pro Genom und pro Gen. Für alle Analysen verwendeten wir die Tabelle pro Genom; Dann haben wir für die Alpha-Diversität alle Proben mit weniger als 1.273.062 Sequenzen pro Probe entfernt und für die Beta-Diversitätsanalyse auf den gleichen Wert verdünnt. Downstream-Analysen wurden in QIIME 2 Version 2020.1158 durchgeführt. Um globale Mikrobiota-Veränderungen zu beurteilen, wurde eine Alpha-Diversitätsanalyse mittels Faiths PD59 und eine Beta-Diversität mittels robuster Hauptkomponentenanalyse (RPCA)60 durchgeführt und die resultierenden Aitchison-Abstände wurden mittels permutationaler multivariater Varianzanalyse (PERMANOVA)61 ausgewertet.

Anschließend haben wir ein Bayes'sches hierarchisches Modell für die unterschiedliche Häufigkeit entworfen, das den Ernährungstyp als festen Effekt und den Käfig als zufälligen Effekt berücksichtigt. Wir modellieren den Zählgenerierungsprozess als negative Binomialverteilung, um Überdispersion zu berücksichtigen. Aufgrund der spärlichen Menge an Mikrobiomdaten haben wir auch die Nullinflation berücksichtigt, indem wir jeder Mikrobe eine Wahrscheinlichkeit zugewiesen haben, dass sie unabhängig vom Prozess der Zählungsgenerierung unbeobachtet bleibt:

Wir haben dieses Modell mit der probabilistischen Programmiersprache Stan62 geschrieben und das Modell mit BIRDMAn (https://github.com/gibsramen/BIRDMAn) angepasst. Um die Zusammensetzung zu berücksichtigen, haben wir dieses Modell angepasst, indem wir die erste Mikrobe in der Tabelle als Referenz für das additive Log-Verhältnis verwendet und nach der Anpassung logarithmische Faltungsänderungen in zentrierte Log-Verhältnis-Koordinaten umgewandelt haben. Als vorherige Verteilungen für die Zielparameter haben wir Folgendes verwendet:

Dabei ist i die Stichprobe, j das Merkmal, y die Mikrobenzahl, θ der Indikator für den nichtbiologischen Nullpunkt, η die mittlere Merkmalszahl, x die Kovariate, β die zu schätzenden Regressionskoeffizienten (log -fache Änderungen), π ist die Wahrscheinlichkeit des nichtbiologischen Nullpunkts, z ist die Käfigidentifikationsvariable, u ist der Zufallseffekt des Käfigs und ϕ ist der Überdispersionsparameter. Um funktionelle Veränderungen zu vergleichen, die mit der unterschiedlichen Häufigkeit des Stammniveaus verbunden sind, wurde ein vergleichender Ansatz zur Vollständigkeit des Genomikpfads gewählt. Zunächst wurde jedes Genom anhand der Vollständigkeit des MetaCyc63-Signalwegs bewertet, wobei der Anteil zwischen null und eins lag, indem charakterisierte Gene den Reaktionen und schließlich den Signalwegen zugeordnet wurden. Jeder Pfad wurde dann durch Spearmans Rangkorrelation mit der aus dem obigen Modell ermittelten Beta-Differenzhäufigkeit korreliert. Die Serinbiosynthese, die Glycinspaltung und die Fettsäuresynthesewege korrelierten signifikant mit Betas. Um diese Korrelationen zu validieren, wurde das logarithmische Verhältnis der Summe der Häufigkeit von Genomen mit vollständigen Signalwegen (Vollständigkeit = 1) im Vergleich zu denen ohne (Vollständigkeit < 1) zwischen den Behandlungsgruppen ausgewertet.

Die Funktion der kleinen sensorischen C-Fasern wurde durch Verhaltensreaktionen auf Hitze mithilfe eines thermischen Nozizeptionstestgeräts (UARD) wie zuvor beschrieben quantifiziert64. Kurz gesagt, die Geräteoberfläche wurde auf 30 °C erwärmt und die Tiere wurden vor dem Test für 20–30 Minuten in einzelne Testkammern gegeben. Es wurden vier separate Reaktionslatenzmessungen durchgeführt und der Mittelwert des letzten Dreifachversuchs herangezogen, um die Reaktionslatenz für jedes Tier darzustellen. Alle Messungen wurden an codierten Tieren von einem Beobachter durchgeführt, der die Behandlungsgruppen nicht kannte.

Die Tiere wurden auf den von Frey-Stand gestellt und 20–30 Minuten lang akklimatisiert. Es wurde der Bereich der manuellen von Frey-Filamente verwendet: 2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 3,84, 4,08, 4,31, 4,56, 4,74 (Kom Kare). Der Test begann mit dem 3,84-Filament und der ausgeübte Druck wurde fünfmal wiederholt. Wenn eine positive Reaktion beobachtet wurde, wurde das nächstniedriger gewichtete Filament in der Sequenz verwendet. Im Falle einer negativen Antwort wurde das nächsthöhere gewichtete Filament angewendet. Alle Messungen wurden an codierten Tieren von einem Beobachter durchgeführt, der die Behandlungsgruppen nicht kannte.

Die Leitung eines motorischen Nervs wurde bei anästhesierten Mäusen mit dem EZ Anesthesia Versaflex-System (Braintree Scientific, Z-7150) quantifiziert. Kurz gesagt, leicht anästhesierte Mäuse wurden auf eine wasserbeheizte Unterlage gebracht, wobei die Anästhesie über eine Gesichtsmaske aufrechterhalten wurde. Zwei Aufzeichnungselektroden aus Platin wurden zwischen der zweiten, dritten und vierten Zehe des Tieres eingeführt und eine Erdungselektrode in die Haut am Hals. Der PowerLab-Stimulator lieferte alle 2 s einen Rechteckwellenreiz mit 200 mV und 50 µs. Die Stimulationselektrode wurde in den Knöchel nahe der Achillessehne und anschließend in die Ischiaskerbe an der Hüfte eingeführt und M-Wellen aufgezeichnet. Die Latenz zwischen Achillessehne und Ischiaskerbe wurde wie beschrieben zur Berechnung der Nervenleitungsgeschwindigkeit verwendet64. Alle Messungen wurden an codierten Tieren von einem Beobachter durchgeführt, der die Behandlungsgruppen nicht kannte.

Die Quantifizierung der Hornhautnerven wurde an anästhesierten Mäusen (unter Verwendung des EZ Anesthesia Versaflex-Systems, Braintree Scientific, Z-7150) unter Verwendung des Retina Tomograph 3 mit Rostock Cornea Module (Heidelberg Engineering), ausgestattet mit Tomocap (Heidelberg Engineering, 0220-001), wie zuvor beschrieben, durchgeführt64. Kurz gesagt, leicht anästhesierte Mäuse wurden auf eine Kleintierplattform überführt, wobei die Anästhesie über eine Gesichtsmaske aufrechterhalten wurde. Vierzig aufeinanderfolgende Bilder mit einheitlicher Vergrößerung und Größe wurden gesammelt und diejenigen identifiziert, die Nerven des subbasalen Plexus enthielten. Die ImageJ-Software (ImageJ 1.53e Java 1.8.0_172) wurde verwendet, um den Hornhautnervbereich in jedem Bild zu quantifizieren, wobei die Daten als Pixel/Bild dargestellt wurden. Alle Messungen wurden an codierten Tieren und Bildern von einem Beobachter durchgeführt, der die Behandlungsgruppen nicht kannte.

Die Quantifizierung der epidermalen Innervation wurde in Pfotenhautproben durch Immunfärbung auf das panneuronale Protein PGP9.5 durchgeführt, wie zuvor ausführlich beschrieben64. Kurz gesagt, Pfotenhautproben wurden in 4 % gepuffertem Paraformaldehyd (Thermo Scientific, J19943-K2) gesammelt. Die Färbung der Epidermisnerven wurde mit einem Anti-PGP9.5-Antikörper (ProteinTech, 14730-1-AP; Verdünnung 1:500) durchgeführt. Unter Verwendung einer 40-fachen Vergrößerung eines Lichtmikroskops wurde die Anzahl der in der Epidermis vorhandenen PGP9.5-positiven Profile berechnet, die Länge des Hautabschnitts berechnet und die IENF-Profildichte als Profile mm−1 ausgedrückt. Alle Messungen wurden auf codierten Objektträgern von einem Beobachter durchgeführt, der die Behandlungsgruppen nicht kannte.

Polare Plasmametaboliten wurden aus 3 µl Plasma extrahiert, das mit einer bekannten Menge an 13C- und 15N-markierten Standards versetzt war (Cambridge Isotope Laboratories, MSK-A2-1.2). Die Extraktion von Gewebemetaboliten wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt21. Kurz gesagt, ~20 mg Gewebe wurden 2 Minuten lang unter Verwendung von Precellys-Perlen mit 500 µl −20 °C Methanol, 400 µl eiskalter Kochsalzlösung und 100 µl eiskaltem Wasser homogenisiert und mit 13C/15N-Standards für polare Metaboliten (Cambridge Isotope) versetzt Laboratories, MSK-A2-1.2), 20 pmol Sphinganin-d7 (Avanti Polar Lipids, 860658), 2 pmol Desoxysphinganin-d3 (Avanti Polar Lipids, 860474), 100 pmol 13C-Dihydroceramid-d7 (Avanti Polar Lipids, 330726), 200 pmol C15-Ceramid-d7 (Avanti Polar Lipids, 860681), 10 pmol d18:1-d7-Glucosylsphingosin (Avanti Polar Lipids, 860695), 100 pmol d18:1-d7/15:0-Glucosylceramid ( Avanti Polar Lipids, 330729), 100 pmol d18:1-d7/15:0 Lactosylceramid (Avanti Polar Lipids, 330727), 200 pmol Sphingosin-d7 (Avanti Polar Lipids, 860657) und 200 pmol d18:1/ 18:1-d9 Sphingomyelin (Avanti Polar Lipids, 791649). Die Identifizierung von 1-Desoxydihydroceramiden wurde durch Retentionszeitabgleich und Analyse der Standards m18:0/24:1 DesoxyDHCer (Avanti Polar Lipids, 860464) und m18:0/16:0 DesoxyDHCer (Avanti Polar Lipids, 860462) sowie Normalisierung bestätigt für 1-Desoxydihydroceramide wurde mit dem 13C-Dihydroceramid-d7-Standard durchgeführt. Zur Bestimmung des Gewebeproteingehalts mittels BCA-Proteinassay (Lambda Biotech, G1002) wurde ein Homogenat-Aliquot von 50 µl entnommen. Das verbleibende Homogenat wurde in ein 2-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und 1 ml Chloroform bei –20 °C hinzugefügt. Die Proben wurden 5 Minuten lang vortexiert und 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert. Die organische Phase wurde gesammelt und 2 μl Ameisensäure zur verbleibenden polaren Phase gegeben, die mit 1 ml Chloroform bei –20 °C erneut extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet und das Pellet in 100 μl Puffer, der 100 % Methanol, 1 mM Ammoniumformiat und 0,2 % Ameisensäure enthielt, resuspendiert. Die Daten stellen Ionenzahlen dar, die durch klassenspezifische interne Standards und den Gewebeproteingehalt normalisiert wurden, mit gestapelten Diagrammen zur Darstellung der Acylkettenverteilung.

Die Quantifizierung polarer Metaboliten wurde nach Derivatisierung mit 2 % (Gew./Vol.) Methoxyaminhydrochlorid (Thermo Scientific) in Pyridin (37 °C für 60 Minuten) und mit N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (MTBSTFA) mit 1 % tert-Butyldimethylchlorsilan bestimmt (tBDMS) (Regis Technologies) (37 °C für 30 Min.). Polare Derivate wurden durch GC-MS unter Verwendung einer DB-35MS-Säule (30 m × 0,25 mm Innendurchmesser × 0,25 μm, Agilent J&W Scientific) analysiert, die in einem Agilent 7890 A-Gaschromatographen installiert war, der mit einem Agilent 5975 C-Massenspektrometer verbunden war, wie zuvor beschrieben65. Die Plasmaglukoseanreicherung wurde mithilfe der Propionsäureanhydrid-Derivatisierung wie zuvor beschrieben66 bestimmt. Die natürliche Isotopenhäufigkeit wurde mithilfe eines internen Skripts51 korrigiert.

Die Quantifizierung der Sphingolipid-Metaboliten wurde mithilfe einer Triple-Quadrupol-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Plattform (Agilent 6460) bestimmt. Sphingolipid-Spezies wurden auf einer C8-Säule (Spectra 3 μm C8SR 150 × 3 mm Innendurchmesser, Peeke Scientific) wie zuvor beschrieben aufgetrennt67. Die mobile Phase A bestand aus 100 % Wasser in HPLC-Qualität mit 2 mM Ammoniumformiat und 0,2 % Ameisensäure, und die mobile Phase B bestand aus 100 % Methanol mit 0,2 % Ameisensäure und 1 mM Ammoniumformiat. Die Flussrate betrug 0,5 ml min−1. Das Gradientenelutionsprogramm bestand aus dem folgenden Profil: 0 min, 82 % B; 3 Min., 82 % B; 4 Min., 90 % B, 18 Min., 99 % B; 25 Min., 99 %, 27 Min., 82 % B, 30 Min., 82 % B. Die Neuäquilibrierung der Säule folgte jeder Probe und dauerte 10 Min. Die Kapillarspannung wurde auf 3,5 kV eingestellt, die Trocknungsgastemperatur betrug 350 °C, die Trocknungsgasdurchflussrate betrug 10 l/min und der Zerstäuberdruck betrug 60 psi. Sphingolipid-Spezies wurden durch selektive Reaktionsüberwachung (SRM) des Übergangs vom Vorläufer zu Produkt-Ionen bei zugehörigen optimierten Kollisionsenergien und Fragmentorspannungen analysiert (Ergänzungstabelle 2). Die Quantifizierung der Sphingolipidspezies wurde unter Verwendung von zugesetzten deuterierten Standards durchgeführt.

Etwa 10–20 mg gefrorenes Gewebe wurden mit 800 µl einer Acetonitril:Methanol:Wasser-Lösung im Verhältnis −20 °C (5:3:2) mit einer bekannten Konzentration von Norvalin als internem Standard unter Verwendung des Precellys Evolution Homogenizer (Bertin Technologies)68 extrahiert . Nach der Extraktion wurde ein 50-µl-Aliquot zur Proteinquantifizierung mittels BCA-Proteinassay (Lambda Biotech, G1002) entnommen und der verbleibende Extrakt 10 Minuten lang bei 21.000 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde dann in ein Glasfläschchen überführt und die chromatographische Trennung und Verbindungsidentifizierung wurde unter Verwendung von Q Exactive Orbitrap MS mit einem Vanquish Flex Binary UHPLC-System (ThermoFisher Scientific) auf einem iHILIC-(P) Classic, 150 mm x 2,1 mm, 5- mm-Partikel, 200-Å-Säule (Hilicon) bei 45 °C. Die Chromatographie wurde unter Verwendung eines Gradienten von 20 mM Ammoniumcarbonat durchgeführt, der mit 0,1 % Ammoniumhydroxidlösung (25 %) (mobile Phase A) und 100 % Acetonitril (mobile Phase B) auf pH 9,4 eingestellt wurde, beide bei einer Flussrate von 0,2 ml/min −1. Der Flüssigkeitschromatographiegradient verlief linear von 80 auf 20 % B von 2 bis 17 Minuten und dann von 20 auf 80 % B von 17 bis 18 Minuten und wurde dann bei 80 % B von 18 bis 25 Minuten gehalten.

Leberproben wurden in 400 µl Methanol bei –20 °C unter Verwendung des Precellys Evolution Homogenizers (Bertin Technologies) extrahiert, der mit EquiSPLASH-markiertem Standard (Avanti Polar Lipids, 330731) und Norvalin versetzt war. Nach der Extraktion wurde ein Aliquot von 50 µl entnommen, um den Proteingehalt mittels BCA-Proteinassay (Lambda Biotech, G1002) zu quantifizieren, und dem verbleibenden Extrakt wurden 400 µl Chloroform bei –20 °C und 400 µl eiskaltes Wasser zugesetzt. Nach 5-minütigem Vortexen wurden die Proben 5 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert und die organische Phase gesammelt. Der verbleibenden polaren Phase wurden zwei Mikroliter Ameisensäure zugesetzt, die mit 400 µl Chloroform bei −20 °C erneut extrahiert wurde. Die Proben wurden im Vortex gemischt und wie oben beschrieben zentrifugiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet und das Pellet in 100 μl Isopropanol resuspendiert.

Die chromatographische Trennung und Identifizierung der Lipidspezies wurde unter Verwendung eines Q Exactive Orbitrap-Massenspektrometers mit einem Vanquish Flex Binary UHPLC-System (Thermo Scientific), ausgestattet mit einer Accucore C30, 150 × 2,1 mm, 2,6 µm Partikelsäule (Thermo), bei 40 °C durchgeführt. Fünf Mikroliter Probe wurden injiziert. Die Chromatographie wurde unter Verwendung eines Gradienten von 40:60 Vol./Vol. Wasser: Acetonitril mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase A) und 10:90 Vol./Vol. Acetonitril: Propan-2-ol mit 10 mM Ammoniumformiat durchgeführt und 0,1 % Ameisensäure (mobile Phase B), beide mit einer Flussrate von 0,2 ml min−1. Der Flüssigkeitschromatographiegradient verlief von 30 % auf 43 % B für 3–8 Minuten, dann von 43 % auf 50 % B für 8–9 Minuten, dann von 50–90 % B für 9–18 Minuten und dann von 90–99 % B von 18 bis 26 Minuten, dann von 26 bis 30 Minuten bei 99 % B gehalten, bevor er in 6 Minuten auf 30 % B zurückkehrte und weitere 4 Minuten lang gehalten wurde.

Lipide wurden im Positivmodus unter Verwendung einer Sprühspannung von 3,2 kV analysiert. Der Spülgasfluss betrug 1 willkürliche Einheit, der Hilfsgasfluss 2 willkürliche Einheiten und der Hüllgasfluss 40 willkürliche Einheiten bei einer Kapillartemperatur von 325 °C. Vollständige Massenspektrometrie (Scanbereich 200–2.000 m/z) wurde mit einer Auflösung von 70.000 mit 106 automatischer Verstärkungsregelung und einer maximalen Injektionszeit von 100 ms verwendet. Es wurde der datenabhängige MS2-Modus (Top 6) mit einer Auflösung von 17.500 und einer automatischen Verstärkungsregelung von 105 mit einer maximalen Injektionszeit von 50 ms verwendet. Die Daten wurden mit der EI-Maven-Software analysiert und die Peaks auf den internen Standard Avanti EquiSPLASH normalisiert. Lipidspezies-spezifische Fragmente, die zur Identifizierung und Quantifizierung verwendet werden, sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt.

Plasmasphingolipide wurden wie zuvor beschrieben mit geringfügigen Modifikationen verarbeitet69. Kurz gesagt, 50 µl Plasma wurden mit 0,5 ml Methanol gemischt und mit internen Standards, Sphinganin-d7, Sphingosin-d7 und Desoxysphinganin-d3 (Avanti Lipide) versetzt. Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 37 °C in einen Mixer gegeben, bei 2.800 g zentrifugiert und der Überstand gesammelt und über Nacht bei 65 °C mit 75 µl methanolischer HCl (1 N HCl, 10 M H2O in Methanol) säurehydrolysiert. Als nächstes wurden 100 µl 10 M KOH zur Neutralisierung hinzugefügt. 625 µl Chloroform, 100 µl 2N NH4OH und 500 µl alkalisches Wasser wurden zugegeben, die Proben vortexiert und 5 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert. Die untere organische Phase wurde dreimal mit alkalischem Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Die LC-MS-Analyse wurde auf einem Agilent 6460 QQQ LC-MS/MS durchgeführt. Die Metabolitentrennung wurde mit einer C18-Säule (Luna 100 × 2,1 mm, 3 µm, Phenomenex) erreicht. Die mobile Phase A bestand aus einem Methanol:Wasser-Verhältnis von 60:40 und die mobile Phase B bestand aus 100 % Methanol mit 0,1 % Ameisensäure, wobei beiden mobilen Phasen 5 mM Ammoniumformiat zugesetzt wurde. Das Gradientenelutionsprogramm bestand aus dem Halten bei 40 % B für 0,5 Minuten, dem linearen Anstieg auf 100 % B über 15 Minuten und dem Beibehalten dieser Temperatur für 9 Minuten, gefolgt von der Wiederherstellung des Ausgangszustands für 10 Minuten. Die Kapillarspannung wurde auf 3,5 kV eingestellt, die Trocknungsgastemperatur betrug 350 °C, die Trocknungsgasdurchflussrate betrug 10 l/min und der Zerstäuberdruck betrug 60 psi. Sphingoidbasen wurden durch SRM des Übergangs von Vorläufer- zu Produkt-Ionen bei zugehörigen optimierten Kollisionsenergien und Fragmentorspannungen analysiert16. Anschließend wurden die Sphingoidbasen anhand versetzter interner Standards bekannter Konzentration quantifiziert.

Gefrorene Leber- und Nierenproben wurden in einem eiskalten Puffer mit 50 mM KH2PO4, 1 mM Na2EDTA und 1 mM DTT, pH 8,0, unter Verwendung eines Glashomogenisators extrahiert. Die maximale Enzymaktivität wurde mithilfe einer gekoppelten Enzymreaktion mit Lactatdehydrogenase (Sigma 10127230001) in Gegenwart von 200 mM Serin, 0,25 mM NADH, 0,17 mM Pyridoxalphosphat und 1 mM DTT für 3 Minuten bestimmt. Die Quantifizierung des Gewebehomogenatproteins wurde anschließend mithilfe des BCA-Proteinassays (Lambda Biotech, G1002) bestimmt und die maximale Enzymaktivität in internationalen Einheiten (U) pro mg Protein ausgedrückt.

RNA wurde aus ~20 mg Lebergewebe mit dem Direct-Zol RNA-Kit (Direct-Zol RNA Miniprep Plus Kit, Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die cDNA-Synthese wurde mit iScript Reverse Transcription Supermix für RT-PCR (iScript Reverse Transcription Supermix, Bio-Rad) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt: 5 Min. bei 25 °C, 20 Min. 46 °C, 1 Min. 95 °C C. PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 96-Well-Platten auf einem Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR System unter Verwendung der folgenden Parameter durchgeführt: 95 °C für 20 s, 40 Zyklen von 95 °C für 1 s und 60 °C für 20 s . Das Endvolumen (10 µl) der PCR-SYBR-Green-Reaktion bestand aus 5 µl Fast SYBR-Green Master Mix (Applied Biosystems), 2 µl cDNA, 1 µl 5 µM Forward- und Reverse-Primern und 1 µl Wasser.

Die verwendeten Primer sind wie folgt. 18 Sekunden vorwärts: AGTCCCTGCCCTTTGTACACA, 18 Sekunden rückwärts: CGATCCGAGGGCCTCACTA; Acc1 vorwärts: AATGAACGTGCAATCCGATTTG, Acc1 rückwärts: ACCCACATTTGCGTAATTGTTG; Acc2 vorwärts: CGCTCACCAACAGTAAGGTGG, Acc2 rückwärts: GCTTGGCAGGGAGTTCCTC; Acly vorwärts: AATCCTGGCTAAAACCTCGCC, Acly rückwärts: GCATAGATGCACACGTAGAACT; Aktin vorwärts: GGCTGTATTCCCTCCATCG, Aktin rückwärts: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT; Aldh1l1 vorwärts: AGCCACCTATGAGGGCATTC, Aldh1l1 rückwärts: TGAGTGTCGAGTTGAAAAACGTC; Aldh1l2 vorwärts: ACCAGCCGGGTTTATTTCAAA, Aldh1l2 rückwärts: ACTCCCACTACTCGGTGGC; Dgat1 vorwärts: CTGATCCTGAGTAATGCAAGGTT, Dgat1 rückwärts: TGGATGCAATAATCACGCATGG; Dgat2 vorwärts: GCGCTACTTCCGAGACTACTT, Dgat2 rückwärts: GGGCCTTATGCCAGGAAACT; Dhcr7 vorwärts: AGGCTGGATCTCAAGGACAAT, Dhcr7 rückwärts: GCCAGACTAGCATGGCCTG; Dhcr24 vorwärts: CTCTGGGTGCGAGTGAAGG, Dhcr24 rückwärts: TTCCCGGACCTGTTTCTGGAT; Dld vorwärts: AGCTGGAGTCGTGTGTACC, Dld rückwärts: GAACCTATCACTGTCACGTCA; Fasn vorwärts: GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT, Fasn rückwärts: TGGGTAATCCATAGAGCCCAG; Fdft1 vorwärts: GTTTGAAGACCCCATAGTTGGTG, Fdft1 rückwärts: CACATCTACGTTCTCTGGCTTAG; Fdps vorwärts: GGAGTCCTAGAGTACAATGCC, Fdps rückwärts: AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC; Ggps1 vorwärts: TTCACAGGCATTTAATCACTGGC, Ggps1 rückwärts: ACCACGTCGGAGCTTTGAAC; Gldc vorwärts: CTCCTGCCCAGACACGAT, Gldc rückwärts: GGGACCGTCTTCTCGATGAG; Gpat1 vorwärts: CTTGGCCGATGTAAACACACC, Gpat1 rückwärts: CTTCCGGCTCATAAGGCTCTC; Gpat4 vorwärts: TCAAAAGAAATTCGTCGAAGTGGT, Gpat4 rückwärts: CCTTTCCGGCAAAAGTAGAAGAT; Hmgcs1 vorwärts: AACTGGTGCAGAAATCTCTAGC, Hmgcs1 rückwärts: GGTTGAATAGCTCAGAACTAGCC; Hmgcr vorwärts: AGCTTGCCCGAATTGTATGTG, Hmgcr rückwärts: TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC; Lss vorwärts: TCGTGGGGGACCCTATAAAAC, Lss rückwärts: CGTCCTCCGCTTGATAATAAGTC; Mthfd1 vorwärts: CTCCTGTCCCAAGTGACATTG, Mthfd1 rückwärts: TAGCCTTCGTTTCCCCGTACA; Mthfd2 vorwärts: AGTGCGAAATGAAGCCGTTG, Mthfd2 rückwärts: GACTGGCGGGATTGTCACC; Mthfd1l vorwärts: GCATGGCCTTACCCTTCAGAT, Mthfd1l rückwärts: GTACGAGCTTCCCCAGATTGA; Mthfd2l vorwärts: AAGGACGTTGATGGATTTCACAT, Mthfd2l rückwärts: GATGATTTCCCAAACGGCACT; Mthfr vorwärts: AGATGAGGCGCAGAATGGAC, Mthfr rückwärts: CATCCGGTCAAACCTGGAGAT; Mtr vorwärts: TCCTCCTCGGCCTATCTTTATTT, Mtr rückwärts: GGTCCGAATGAGACACGCT; Mvk vorwärts: GGTGTGGTCGGAACTTCCC, Mvk rückwärts: CCTTGAGCGGGTTGGAGAC; Mvd vorwärts: ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG, Mvd rückwärts: TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT; Pmvk vorwärts: CCTATGGGGCTGTGATACAGA, Pmvk rückwärts: TCTCCGTGGTTCTCAATGACC; Psat vorwärts: CAGTGGAGCGCCAGAATAGAA, Psat rückwärts: CCTGTGCCCCTTCAAGGA; Psph vorwärts: TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG, Psph rückwärts: TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG; Phgdh vorwärts: ATGGCCTTCGCAAATCTGC, Phgdh rückwärts: AGTTCAGCTATCAGCTCCTCC; Scd1 vorwärts: TTCTTGCGATACACTCTGGTGC, Scd2 rückwärts: CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT; Scd2 vorwärts: GATCTCTGGCGCTTACTCAGC, Scd2 rückwärts: CTCCCCAGTGGTGAGAACTC; Sds vorwärts: GAAGACCCCACTTCGTGACAG, Sds rückwärts: TCTTGCAGAGATGCCCAATGC; Shmt1 vorwärts: CAGGGCTCTGCTTGATGCAC, Shmt1 rückwärts: CGTAACGCGCTCTTGTCAC; Shmt2 vorwärts: TGGCAAGAGATACTACGGAGG, Shmt2 rückwärts: AGATCCGCTTGACATCAGACA; Quadratisch vorwärts: ATAAGAAATGCGGGGATGTCAC, Quadratisch rückwärts: ATATCCGAGAAGGCAGCGAAC; Srebp1a vorwärts: TAGTCCGAAGCCGGGTGGGCGCCGG, Srebp1a rückwärts: GATGTCGTTCAAAACCGCTGTGTGTC; Srebp1c vorwärts: AAGCAAATCACTGAAGGACCTGG, Srebp1c rückwärts: AAAGACAAGCTACTCTGGGAG; Srebp2 vorwärts: GGATCCTCCCAAAGAAGGAG, Srebp2 rückwärts: TTCCTCAGAACGCCAGACTT; Tyms vorwärts: GGAAGGGTGTTTTGGAGGAGT, Tyms rückwärts: GCTGTCCAGAAAATCTCGGGA.

Um die Proteingehalte im Gewebe zu vergleichen, wurden etwa 20 mg Gewebe in RIPA-Puffer, ergänzt mit 5 mM EDTA-Lösung (Thermo Scientific), Protease-Inhibitor-Cocktail (cOmplete, Roche) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (PhosSTOP, Roche), homogenisiert und für 10 Minuten auf Eis gelegt 30 Minuten. Das Gewebelysat wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 g zentrifugiert und der Überstand bei –80 °C gelagert. Der Homogenatproteingehalt wurde mithilfe des Bicinchoninsäure-Assays (Thermo Scientific) bestimmt. Proteinproben wurden in einem Laemmli-Puffer (NuPAGE LDS Sample Buffer, Life Technologies) hergestellt und auf einem 4–15 %igen Fertiggel (Mini-PROTEAN TGX, Bio-Rad) 2 Stunden lang bei konstant 100 V laufen gelassen und auf ein Polyvinylidendifluorid übertragen (PVDF)-Membran für 2 Stunden bei konstant 250 mA in einem eisgekühlten Transfertank. Die Membran wurde mit 5 % Milch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit einem Primärantikörper gegen ACLY (Cell Signaling 13390, 1:1.000), ACC (Cell Signaling 3662, 1:2.000) und p-AKT Ser473 (Cell Signaling 9271) inkubiert , 1:1.000), p-AKT Ser308 (Cell Signaling 9275, 1:1.000), AKT (Cell Signaling 75692, 1:1.000), SCD1 (Cell Signaling 2794, 1:1.000), GAPDH (Cell Signaling 5174, 1: 4.000) und Vinculin (Cell Signaling 4650, 1:1.000). Nach dem Waschen mit TBS-T wurden die Membranen mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten Sekundärantikörper (Cell Signaling 7074, 1:5.000) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und mit verstärkter Chemilumineszenzflüssigkeit (Clarity Western ECL Substrate, Bio-Rad) inkubiert 5 Minuten. Die Densitometrie-Quantifizierung wurde mit der Image Lab-Software (Bio-Rad) durchgeführt. Rohscans mit Molekulargewichtsmarkern finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die statistische Analyse wurde mit der Prism-Software (GraphPad Prism 9.3.1) unter Verwendung eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests zum Vergleich zweier Gruppen, einfaktorielle ANOVA, und des Post-hoc-Tests mit der geringsten signifikanten Differenz nach Fisher zum Vergleich von mehr als zwei Gruppen, zweifaktorielle ANOVA, durchgeführt mit Fishers Post-hoc-Test zur geringsten signifikanten Differenz zum Vergleich des Zwei-Faktor-Studiendesigns und PERMANOVA-Analyse zur Untersuchung von RPCA-Diagrammen. Für alle Tests wurde P < 0,05 als signifikant angesehen. Alle Datenpunkte im Manuskript stellen einzelne biologische Replikate dar. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für Mikrobiom-Algorithmen und Immunoblots werden als ergänzende Informationen bereitgestellt. Die Rohdaten der Genomsequenzierung des gesamten Mikrobioms wurden auf Qiita53 hochgeladen, wo wir dem Standardverarbeitungsworkflow folgten. Hochauflösende und zielgerichtete Massenspektrometriedaten sind auf der Website des National Metabolomics Data Repository (NMDR) des NIH Common Fund, der Metabolomics Workbench, https://www.metabolomicsworkbench.org verfügbar, wo ihnen die Projekt-ID M8JD81 (https:/) zugewiesen wurde. /doi.org/10.21228/M8JD81). Der Zugriff auf die Daten erfolgt direkt über die Projekt-ID M8JD81. Zusätzliche Daten, die die Ergebnisse stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir danken allen Mitgliedern des Metallo-Labors für hilfreiche Diskussionen sowie M. Friedlander, E. Holmes und A. Tayerani für ihre Beiträge. Diese Arbeit wurde vom NIH (R01CA234245 an CMM, NIDDK MICROMouse Funding DK076169 an MKH und R01AG065993 an AC), einem Camille and Henry Dreyfus Teacher-Scholar Award (an CMM), dem Lowy Medical Research Institute (an CMM) und dem American unterstützt Heart Association (18CDA34110292 bis AC). Diese Arbeit wurde auch durch das vom NIDDK finanzierte Stipendium des San Diego Digestive Diseases Research Center (P30 DK120515) unterstützt.

Labor für Molekular- und Zellbiologie, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, USA

Michal K. Handzlik, Jivani M. Gengatharan, Grace H. McGregor, Courtney R. Green, Patrick Tseng und Christian M. Metallo

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Michal K. Handzlik, Jivani M. Gengataran, Grace H. McGregor, Ana M. Moreno, Courtney R. Green, Prashant Mali, Rob Knight und Christian M. Metallo

Abteilung für Pathologie, School of Medicine, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Katie E. Frizzi, Lucie S. Guernsey und Nigel A. Calcutt

Abteilung für Pädiatrie, School of Medicine, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Cameron Martino, Gibraan Rahman, Antonio Gonzalez und Rob Knight

Programm für Bioinformatik und Systembiologie, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Cameron Martino, Gibraan Rahman und Rob Knight

Zentrum für Mikrobiome-Innovation, University of California San Diego, La Jolla, CA, USA

Cameron Martino & Rob Knight

Regulatory Biology Laboratory, The Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, CA, USA

Terry Lin & Satchidananda Panda

Scripps Research, La Jolla, Kalifornien, USA

Yoichiro Ideguchi

Lowy Medical Research Institute, La Jolla, Kalifornien, USA

Regis J. Fallon und Marin L. Gantner

Abteilung für Ernährung und integrative Physiologie, University of Utah, Salt Lake City, UT, USA

Amandine Chaix

School of Agriculture and Food Science, University College Dublin, Dublin, Irland

Martina Wallace

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MKH und CMM haben die Studie entworfen. MKH, JMG, AMM, YI, KEF, LSG, PT und RJF führten Verhaltenstests, GTTs und ITTs durch. MKH, GHM und CRG generierten und analysierten stabile Isotopen-Tracer- sowie gezielte Metabolomics- und Lipidomics-Daten. CM, GR und AG führten Mikrobiomanalysen durch, einschließlich phylogenetischer Alpha- und Beta-Diversität und Signalweganalyse. TL und AC führten Experimente zur Kotbombenkalorimetrie durch. SP-, MW-, PM-, RK-, MLG-, NAC- und CMM-gesteuertes experimentelles Design und Analyse. MKH und CMM haben das Manuskript unter Mitwirkung aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Christian M. Metallo.

CMM ist wissenschaftlicher Berater für Faeth Therapeutics. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

(a) Glycin-, Serin- und Methioninspiegel bei WT- und BKS-db/db-Mäusen in der Niere (n = 6 pro Gruppe). (b) Glycin-, Serin- und Methioninspiegel bei WT- und BKS-db/db-Mäusen im inguinalen Fettgewebe (iWAT) (n = 6 pro Gruppe). (c) Plasmametabolitenspiegel in WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). (d) mRNA-Expression von Nierenenzymen, die den Serin-, Glycin- und Ein-Kohlenstoff-Metabolismus in WT- (n = 6) und BKS-db/db-Mäusen (n = 5) regulieren. (e) Serintoleranztest (STT) bei C57BL/6J-Mäusen nach einem Fasten über Nacht (n = 4 pro Dosis). (f) Gewebe-Serin-Markierungsfraktion bei WT-Mäusen 15 Minuten nach der Verabreichung von [U-13C3]Serin über eine orale Sonde (n = 4 pro Gewebe) nach einem Fasten über Nacht. (g) Gewebe-Citrat-Markierungsfraktion bei WT-Mäusen 15 Minuten nach der Verabreichung von [U-13C3]Serin über eine orale Sonde (n = 4 pro Gewebe) nach einem Fasten über Nacht. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests (a–d) analysiert. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 im Vergleich zur WT-Gruppe.

(a) Serin-Dehydratase-Aktivität, bestimmt in Leber und Niere bei C57BL/6J-Mäusen im gefütterten Zustand (n = 5 pro Gewebe). (b) Seruminsulin in WT- und BKS-db/db-Mäusen, quantifiziert nach einem 6-stündigen Fasten (n = 6 pro Gruppe). (c) Serumglukagon in WT-Mäusen (n = 5) und BKS-db/db-Mäusen (n = 6), quantifiziert nach einem 6-stündigen Fasten. (d) Pharmakokinetik der Plasmaglukose und Fläche unter der Kurve (AUCGLC) bei WT- und BKS-db/db-Mäusen nach GTT/STT mit einer Glucosedosis von 2 g/kg (n = 6 pro Gruppe) nach einem Fasten über Nacht. (e) Plasma-Glycin-Pharmakokinetik und Fläche unter der Kurve (AUCGLY) bei WT- und BKS-db/db-Mäusen nach GTT/STT mit Glukose in einer Dosierung von 2 g/kg (n = 6 pro Gruppe) nach einem Fasten über Nacht. (f) Serintoleranztest (STT) und Fläche unter der Kurve (AUCSER) bei WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe), denen Serin (400 mg/kg) erst nach einem Fasten über Nacht verabreicht wurde. (g) Nüchtern-Plasmainsulinspiegel (6 Stunden) bei C57BL/6J-Mäusen, die 1 Woche nach der Injektion mit Vehikel oder Streptozotocin (STZ) behandelt wurden (n = 9 pro Gruppe). (h) Nüchternblutzucker (6 Stunden) bei C57BL/6J-Mäusen, die 1 Woche nach der Injektion mit Vehikel oder Streptozotocin (STZ) behandelt wurden (n = 9 pro Gruppe). (i) Körperfettmassengehalt bei C57BL/6J-Mäusen, die 1 Woche nach der Injektion mit Vehikel oder Streptozotocin (STZ) behandelt wurden (n = 9 pro Gruppe). (j) Nüchtern-Plasma-Aminosäurekonzentration (6 Stunden) bei C57BL/6J-Mäusen, die 1 Woche nach der Injektion mit Vehikel (n = 9) oder Streptozotocin (STZ, n = 10) behandelt wurden. (k) Plasmaglukose-Pharmakokinetik und Fläche unter der Kurve (AUCGLC) nach einem Fasten über Nacht während GTT/STT bei C57BL/6J-Mäusen, die 2 Wochen nach Injektionen mit verabreichter Glukose mit Vehikel (n = 7) oder Streptozotocin (STZ, n = 6) behandelt wurden bei 2 g/kg. (l) Thermische Latenz bei 14 Wochen alten WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). (m) Taktile Wahrnehmung bei 14 Wochen alten WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). (n) Geschwindigkeit der motorischen Nervenleitung bei 14 Wochen alten WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests (b–n) und einer zweiseitigen ANOVA mit Fishers LSD-Post-hoc-Test (e–f, k Zeitverlaufsexperimente) analysiert ).

(a) Plasma-Aminosäurespiegel im gefütterten Zustand bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 5), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 8) oder einer fettreichen Diät (HFD, n = 8) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 8) für 18 Wochen. (b) Lebermetabolitengehalt bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 10) oder einer fettreichen Diät (HFD, n = 10) gefüttert wurden, und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 10) für 18 Wochen. (c) Körpergewichtszunahme 18 Wochen nach der diätetischen Intervention (n = 13 pro Gruppe). (d) Nahrungsaufnahme als Reaktion auf eine 18-wöchige diätetische Fütterung bei Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD). , n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = = 13). (e) Kalorienaufnahme als Reaktion auf eine 18-wöchige diätetische Fütterung bei Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD). , n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 13). (f) Kalorienabsorption als Reaktion auf eine 18-wöchige diätetische Fütterung bei Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD). , n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 13). (g) Wasseraufnahme als Reaktion auf eine 18-wöchige diätetische Fütterung bei Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD). , n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 13). (h) Körperliche Aktivität als Reaktion auf eine 18-wöchige diätetische Fütterung bei Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD). , n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 13). (i) Repräsentative Bilder und Quantifizierung der Adipozytengröße als Reaktion auf eine 18-wöchige Nahrungsfütterung bei Mäusen mit fettarmer Ernährung (LFD, n = 10), Serin/Glycin-freiem LFD (-SG LFD, n = = 12) , fettreiche Ernährung (HFD, n = 13) und Serin/Glycin-freie HFD (-SG HFD, n = 13). (j) IP-Glukosetoleranztest 18 Wochen nach der Fütterung mit einer fettarmen Diät (LFD) oder einer fettreichen Diät (HFD), die reich an Serin und Glycin ist oder ihnen fehlt (n = 13 pro Gruppe). (k) IP-Insulintoleranztest 18 Wochen nach der Fütterung mit einer fettarmen Diät (LFD) oder einer fettreichen Diät (HFD), die reich an Serin und Glycin ist oder ihnen fehlt (n = 15 pro Gruppe). (l) Zeitverlauf des respiratorischen Austauschverhältnisses 18 Wochen nach der Fütterung von Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 12) und einer fettreichen Diät (HFD, n =). 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = = 13). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Fisher-LSD-Post-hoc-Test (a–k) analysiert. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 vs. LFD. # P < 0,05 vs. HFD-Gruppe.

(a) Robuste Hauptkomponentenanalyse der Beta-Diversität des Mikrobioms 18 Wochen nach der Fütterung von Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 10) und einer fettreichen Diät (HFD, n = 9) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 9). (b) Log-Verhältnis von Arten mit vollständigen vs. unvollständigen Wegen für die L-Serin-Biosynthese 18 Wochen nach der Fütterung von Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), Serin/Glycin-freiem LFD (-SG LFD, n = 10), fettreiche Ernährung (HFD, n = 9) und Serin/Glycin-freie HFD (-SG HFD, n = 9). (c) Log-Verhältnis von Arten mit vollständigen vs. unvollständigen Wegen für die Glycinspaltung 18 Wochen nach der Fütterung von Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), Serin/Glycin-freiem LFD (-SG LFD, n = 10) , fettreiche Ernährung (HFD, n = 9) und Serin/Glycin-freie HFD (-SG HFD, n = 9). (d) Log-Fold-Change der Mikrobiomarten 18 Wochen nach der Fütterung von Mäusen mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 10), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 10) und einer fettreichen Diät (HFD, n = 9) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 9). Die Daten werden als Minimum/Maximum (b–c) dargestellt und mithilfe eines PERMANOVA-Tests (a) und einer Zwei-Wege-ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (b–c) analysiert.

(a) Anreicherung von schwerem Wasser (D2O) im Plasma bei Mäusen, die mit fettarmer Diät (LFD, n = 3), Serin/Glycin-freiem LFD (-SG LFD, n = 4) und fettreicher Diät (HFD, n =) gefüttert wurden 5) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 5). (b) De-novo-Cholesterinsynthese bei Mäusen, die 18 Wochen lang mit LFD (n = 3), -SG LFD (n = 4), HFD (n = 5) und -SG HFD (n = 5) gefüttert wurden. (c) Leberproteinexpression von ATP-Citrat-Lyase (ACLY), Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) und Steroyl-CoA-Desaturase 1 (SCD1), P-AktS473 und P-AktT308 (n = 3 pro Gruppe). (d) Hepatische mRNA-Expression von ATP-Citrat-Lyase (Acly), Acetyl-CoA-Carboxylase (Acc2) und Steroyl-CoA-Desaturase 1 (Scd1) in Mäusen, die mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 8), Serin/ glycinfreies LFD (-SG LFD, n = 11), fettreiche Diät (HFD, n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 10). (e) Leber-mRNA-Expression von Enzymen, die an der Fettsäure- und Cholesterinsynthese beteiligt sind, bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät (LFD, n = 8), einer Serin/Glycin-freien LFD (-SG LFD, n = 11) und einer fettreichen Diät gefüttert wurden (HFD, n = 13) und Serin/Glycin-freies HFD (-SG HFD, n = 10). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (a–e) analysiert. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 vs. LFD. # P < 0,05 vs. HFD-Gruppe.

(a) Quantifizierung der thermischen Latenz bei C57BL/6J-Mäusen, die 12 Monate lang entweder mit einer Kontrolldiät (n = 10) oder mit Serin/Glycin-freiem Futter (-Ser/Gly, n = 10) gefüttert wurden. (b) Repräsentative Bilder der intraepidermalen Nervenfaserdichte (IENF) und Quantifizierung von IENF in der Pfotenhaut bei Mäusen, die 12 Monate lang entweder mit einer Kontrolldiät (n = 2) oder einer Serin/Glycin-freien Diät (n = 3) gefüttert wurden. Die PGP9.5-Färbung von IENF ist durch Pfeile dargestellt. (c) Zeitverlauf des Körpergewichts bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freiem LFD gefüttert wurden + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10), HFD + Myriocin ( HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9). (d) Körpergewichtszunahme 6 Monate nach der diätetischen Intervention bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10), Serin/ glycinfreies LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10), HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9) . (e) Fettgewebegröße 6 Monate nach der diätetischen Intervention bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 9), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10), Serin/ glycinfreies LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10), HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9) . (f) Plasma-Aminosäurekonzentration 6 Monate nach der diätetischen Intervention bei Mäusen, die mit fettarmer Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10) und Serin gefüttert wurden /glycinfreies LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10) , HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9). ). (g) Stapeldiagramm der Leberceramide bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-frei gefüttert wurden LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10), HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9). (h) Stapeldiagramm der Ischiasnerv-Ceramide bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin gefüttert wurden. freies LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10), HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9). (i) Stapeldiagramm von Ischiasnerv-Desoxydihydroceramid (DesoxyDHCer) bei Mäusen, die mit fettarmer Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), LFD + 0,3 mg/kg Myriocin (LFD+Myr, n = 10) und Serin gefüttert wurden /glycinfreies LFD + Vehikel (-SG LFD+Veh, n = 10), -SG LFD + Myriocin (-SG LFD+Myr, n = 9), fettreiche Ernährung + Vehikel (HFD+Veh, n = 10) , HFD + Myriocin (HFD+Myr, n = 10), Serin/Glycin-freies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 10) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 9). ). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (a und c) und einer einfaktoriellen ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (d–i) analysiert. Statistische Analysen im GI wurden unter Verwendung summierter Sphingolipidhäufigkeiten durchgeführt.

(a) Repräsentative Bilder der intraepidermalen Nervenfaserdichte (IENF) bei Mäusen, die mit fettarmer Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 10), fettreicher Diät + Vehikel (HFD+Veh, n = 7), Serin/ glycinfreies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 12) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 8). (b) Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Hornhautnerven bei Mäusen, die mit fettarmer Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 12), fettreicher Diät + Vehikel (HFD+Veh, n = 12) und ohne Serin/Glycin gefüttert wurden HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 12) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 11). (c) Tastsinn bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 12), einer fettreichen Diät + Vehikel (HFD+Veh, n = 12), Serin/Glycin-freiem HFD + Vehikel (-) gefüttert wurden. SG HFD+Veh, n = 12) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 11). (d) Geschwindigkeit der motorischen Nervenleitung bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 12), einer fettreichen Diät + Vehikel (HFD+Veh, n = 12), Serin/Glycin-freiem HFD + Vehikel gefüttert wurden (-SG HFD+Veh, n = 12) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 11). (e) Hochauflösende Lipidomics-Analyse der Leber im gefütterten Zustand bei Mäusen, die mit einer fettarmen Diät + Vehikel (LFD+Veh, n = 12), einer fettreichen Diät + Vehikel (HFD+Veh, n = 12), Serin/ glycinfreies HFD + Vehikel (-SG HFD+Veh, n = 12) und -SG HFD + Myriocin (-SG HFD+Myr, n = 11). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (b–e) analysiert.

a) Konzentration von hydrolysiertem Plasma-Desoxysphinganin (DeoxySA) bei 16 Wochen alten WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). b) Hepatische gezielte Sphingolipidbestimmung bei 16 Wochen alten WT- und BKS-db/db-Mäusen (n = 6 pro Gruppe). c) Zeitverlauf der thermischen Latenz bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (0,3 mg/kg jeden zweiten Tag, n = 9) behandelt wurden. d) Taktile Wahrnehmung bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n=10) oder Myriocin (n=9) behandelt wurden. e) Intraepidermale Nervenfaserdichte in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. f) Zeitlicher Verlauf des Körpergewichts bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. g) Blutzucker-Zeitverlauf im nüchternen Zustand (6 Stunden) bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. h) Nüchterner (6-stündiger) Plasma-Serin-Zeitverlauf bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 8) behandelt wurden. i) Summe der hepatischen Sphingolipide in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. j) Summe der Sphingolipide der Pfotenhaut von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. k) Stapeldiagramm der Leber-Desoxydihydroceramid (DesoxyDHCer)-Spezies in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. l) Stapeldiagramm der Pfotenhaut-Desoxydihydroceramid (DesoxyDHCer)-Spezies in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. m) Stapeldiagramm der Leber-Sphingomyelin (SM)-Spezies in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. n) Stapeldiagramm der Pfotenhaut-Sphingomyelin (SM)-Spezies in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit Vehikel (n = 10) oder Myriocin (n = 9) behandelt wurden. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mithilfe eines zweiseitigen unabhängigen t-Tests (a–b,d–e, i–n) und einer zweiseitigen ANOVA mit Fishers LSD-Post-hoc-Test (ca ,f–h). Statistische Analysen in kn wurden unter Verwendung summierter Sphingolipidhäufigkeiten durchgeführt.

a) Zeitverlauf des Körpergewichts bei BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontrolldiät (n = 8) oder einer Serin-ergänzten Diät (n = 9) gefüttert wurden. b) Nüchternblutzucker-Zeitverlauf (6 Stunden) in BKS-db/db, gefüttert mit einer Kontrolldiät (n = 8) oder einer Serin-ergänzten Diät (n = 9) über 8 Wochen. c) Summierte hepatische Sphingolipide in BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder mit Serin ergänzten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). d) Summe der Sphingolipide der Pfotenhaut von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder mit Serin angereicherten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). e) Spiegel der Sphingomyelin-Spezies (SM) in der Leber von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder Serin-ergänzten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). f) Konzentrationen von Sphingomyelin-Spezies (SM) in der Pfotenhaut von BKS-db/db-Mäusen, die 8 Wochen lang entweder mit einer Kontroll- oder Serin-ergänzten Diät gefüttert wurden (n = 8 pro Gruppe). Die Daten sind Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) und wurden mit einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem LSD-Post-hoc-Test nach Fisher (a–b) und einem zweiseitigen unabhängigen t-Test (c–f) analysiert. Statistische Analysen in ef wurden unter Verwendung summierter Häufigkeiten durchgeführt.

Ergänzende Abbildung 1 enthält die rohen Western-Blot-Bilder.

Nahrungszusammensetzung.

LC-MS/MS-Übergänge.

Hochauflösende Massenspektrometrieübergänge.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Handzlik, MK, Gengatharan, JM, Frizzi, KE et al. Der durch Insulin regulierte Serin- und Lipidstoffwechsel treibt die periphere Neuropathie voran. Natur 614, 118–124 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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Eingegangen: 20. Dezember 2021

Angenommen: 07. Dezember 2022

Veröffentlicht: 25. Januar 2023

Ausgabedatum: 02. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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